第十三章 血栓与止血检验

来源:互联网 由 是一地和 贡献 责任编辑:李志  

以下内容为系统自动转化的文字版,可能排版等有问题,仅供您参考:

第十三章 血栓与止血检验

编辑制作 熊石龙

一、基本理论

血管壁的结构

?

血管壁的正常结构包括三层:内层、中层和外层

内层:内皮细胞+基底膜 内皮细胞管壁有肝素类物质

内皮细胞内含细胞器

(棒状小体 vWF和t-PA,TM,AT-Ⅲ,PAI-1等 ) 中层:平滑肌细胞(脉细血管无此层) 外层:结缔组织

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

一、基本理论

血管壁的止血功能

激活血 小板

收缩 反应

激活凝 血过程

抗血 栓特 性

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

血小板的止血功能

血管损伤(抗血栓特性降低) 血管收缩 激活凝血过程

血流减慢 血管内皮下成分暴露

纤维蛋白形成

血小板黏附、聚集、释放

血栓形成

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

二、血管壁(内皮)检验

血浆血管性血友病因子抗原vWF:Ag,ELISA法

原理纯化的兔抗人vWF:Ag抗体包被聚苯乙烯反应板,加入

稀释的待测血浆,样本中的vWF:Ag结合于固相的抗体 上,然后加入酶标记兔抗人vWF:Ag抗体,与其定量结

合,洗去多余抗体后,加底物显色,通过查找标准曲

线,即可计算出vWF:Ag的含量。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

vWF:Ag 操作

?

单抗以0.1mol/L的碳酸盐缓冲液(pH9.5)稀释成 10μg/ml加入反应板中,每孔0.2ml,置于湿盒中4℃ 过夜。

?

0.05%Tween—20,0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4, Tween—PBS)洗3次后加入用0.4%BSA—PBS稀释的待 测血浆或培养液上清,每孔0.2ml,37℃温育2小时。

同前洗涤3次后,加入用同上缓冲液稀释的酶标vWF单 抗,每孔0.2ml,37℃温育2小时。

?

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

vWF:Ag 操作

?

同前洗涤5次后,每孔加底物溶液(OPD 1mg/ml,用 0.1ml/L,pH4.5的枸橼酸盐缓冲液配制,30%过氧化 氢0.5μg/ml)0.2ml,置室温约5分钟后,各孔加 3mol/L硫酸0.05ml终止反应。

室温放置10min后在酶标仪上测定492nm处的吸光度值。

绘制标准曲线 正常混合血浆以0.4%BSA—PBA按1: 20、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000六种 浓度稀释,与待测样品在相同条件下测定。

? ?

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

vWF:Ag 参考区间

参考值: 61.6%~126.6%

注意事项

对血浆vWF:Ag浓度过高的标本,应稀释后再测定。

所有ELISA测定中应注意的事项均应引起重视。

除本方法外,也可以采用胶乳增强免疫比浊法。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

vWF:Ag 应用评价

血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断 1.减低 见于血管性血友病(vWD),是诊断vWD及其分型的重要依据 2.升高 见于血栓性疾病,如急性冠脉综合征(ASC)、心肌梗死、 脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等,同时也见 于剧烈运动后,肾上腺素受体被兴奋等。

应用评价以前vWF:Ag定量常采用免疫火箭电泳,由于操作较为复杂,现 在少用。

ELISA常用于定量检测vWF:Ag,但是胶乳增强的免疫比浊 法更为简便快速,而且可以在全自动血凝仪上进行测定。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

凝血酶调节蛋白,TM

原理将抗人凝血酶调节蛋白(Thrombomdulin,TM)

单克隆抗体包被于聚苯乙烯放免小杯中,样本中的TM 结合于包被的放免小杯上,加入125I-抗人TM单抗, 根据结合的125I放射性强度计算出样品中TM的含量。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

TM 操作

1.绘制校正曲线 人TM标准品用缓冲液A做倍比稀释,TM的浓度分别 为500,250,125,31.25,15.6,7.3,3.9和0ng/ml,以人TM浓度 为横坐标,以cpm为纵坐标绘制校正曲线。

2.将200μl的抗人TM单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中,4℃过夜, 用洗涤液A洗3次,将待测样本(或标准品)0.25ml与等量缓冲液A 混合,每小杯加入20μl稀释样品液(空白管加入缓冲液A),37℃ 水浴2h,用洗涤液A洗3次,加入200μl125I-抗人TM单抗,37℃水 浴2h,再用洗涤液B洗六次,在γ闪烁测定仪上测定放射活性,在 校正曲线上查出相应的浓度。

TM 参考区间 25~52μg/L

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

TM 应用评价

TM是由血管内皮细胞合成和分泌释放的,它表达于血管内皮细胞 表面,和循环血液中的凝血酶形成 1: 1的TM-凝血酶复合物,此复合 物将蛋白C(PC)激活为活化蛋白C(APC),APC有灭活FⅧa、FⅤa和 激活纤溶活性的作用,因此TM对于血管的抗凝作用十分重要。

正常情 况下,血浆中TM的含量很低,但当血管内皮受损后,血浆中的TM含量 明显升高且与内皮的损伤程度相关。

目前认为, TM:Ag 的检测是了解 血管内皮损伤最好的指标。

TM:Ag的水平升高 见于血栓性疾病,如糖尿病、心肌梗死、脑血

栓、深静脉血栓形成( DVT)、DIC等。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

TM 注意事项

1.如果样品不能当天测定,应在采血后立即将血浆分离 出放于-20℃冷冻保存。

冷冻的样品复溶时应在37℃ 水浴中进行,室温中缓慢解冻则可导致TM沉淀。

2. 若样本中的TM含量超过校正曲线范围应适量稀释后 再次测定。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

血浆6-酮-前列腺素F1α检测

原理 ELISA法:将抗原(血浆6-酮-前列腺素F1α-

牛血清白蛋白连接物)包被于固相载体上,与游离抗 原(待测样品或6-酮-前列腺素F1α标准品)竞争性 地与一定量的抗6-酮-PGF1α抗体结合,洗涤后加入 过量的酶标记第二抗体,再加入底物显色。

待检血浆 或标准品中的6-酮-PGF1α含量与显色程度呈负相关, 根据显色程度(A值)即可从标准曲线中推算出待检 血浆中6-酮-PGF1α的含量。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

血浆6-酮-前列腺素F1α 检测 操作步骤

1.标本采集 顺利采取静脉血后与5%EDTA-Na2进行9:1抗凝混 匀,3000r/min离心20min分离出血浆。

2.用碳酸盐缓冲液将6-酮-PGF1α-BSA作一定稀释后包被于酶 标反应板,再用0.3%明胶封闭。

加入标准品(倍比稀释成 12.5~1600pg/ml 浓度)或待测样品、兔抗6酮PGF1αIgG100μl后在37℃中温育2h。

洗涤后再加入酶标 第二抗体200μl在37℃反应2h。

以OPD-过氧化氢为基质显 色20min,加入3mol/L硫酸中止反应,在酶标检测仪上测 定490nm处的吸光度值A。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

血浆6-酮-前列腺素F1α 检测 参考区间

标准曲线与计算

A标准品或样品 — A非特异 B/B0(%) ? ?100% A零标准孔 — A非特异

式中:B为测定管;B0为不加样品管,最大结合率管; B/B0为结合率。

以标准品含量为横坐标,B/B0(%)为纵坐标,在半对 数纸上绘制出标准曲线。

根据样品孔B/B0(%)值在标 准曲线上读出6-酮-PGF1α的含量。

样品6-酮-PGF1α浓度(pg/ml)=测定值×10。

参考范围10.7~25.1 pg/ml。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

血浆6-酮-前列腺素F1α 检测 应用评价

血浆6-酮-前列腺素F1α是血管内皮细胞膜上PGG2 和PGH2代谢的终末产物,检测血浆中6-酮-前列腺素 F1α的水平能客观的反映血管内皮的功能,有助于对 血管内皮损伤程度的了解和疗效评价。

血浆6-酮-前列腺素F1α减低 见于血栓性疾病, 如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、动脉粥样硬 化、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。

第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验

第二节 血小板止血作用及检验

学习要点

?

了解血小板的超微结构,在此基础上理解血小板

的止血功能。

?

理解并掌握血小板止血功能实验室检查的临床应

用及评价。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

一、基本理论

血小板概述

?

血小板(blood platelet)由骨髓中成熟巨核细胞的 质分割生成,是哺乳动物血液中体积最小的血细胞。

血小板数量:(100~300) x109个/L(成年人)。

血小板寿命:7~10天。

主要功能:促进止血和加速凝血,在止血、伤口愈

? ? ?

合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理

过程中起重要作用。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板结构

?

光学显微镜:一般表现为多形态,

直径1~4μm,具有运动和变形能力。

瑞氏染色后见血小板胞质呈灰蓝色 或淡红色,无胞核,中心部位有较 多紫红色嗜苯胺蓝颗粒。

?

电子显微镜:血小板结构由外向

内可分为表面结构、溶胶质层结构

和细胞器内含物三层。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板超微结构—功能基础

1.血小板表面结构 由血小板膜、细胞外衣和开放管道系统(open

canalicular system,OCS)组成。

重要成分:磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine,PS)/血细胞第3因子(PF3) 血小板膜糖蛋白等。

2.溶胶质层结构

由微管、微丝、致密管道系统等组成。

主要致密颗粒和α-颗粒、溶酶体组成。

3.细胞器内含物结构

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板的花生四烯酸 代谢途径

环氧化酶

膜磷脂 磷脂酶A2 花生四烯酸

花生四烯酸是膜磷脂代 谢产物,其代谢途径是 血小板发挥聚集止血功 能的主要代谢基础。

前列环素 合成酶

前列腺素环内过氧化物PGG2 过氧化物酶 前列腺素环内过氧化物PGH2 血栓烷A2 合成酶 血栓烷A2(TXA2) 30s后 血栓烷B2(TXB2) (稳定产物) 血小板内完成 第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

前列环素(PGI2) 2~3min后 6-酮-PGF1α (稳定产物) 血管内皮细胞内完成

血小板的止血功能

血小板的止血功能

血小板 粘附 血小板 聚集

血块 收缩 释放 反应 促凝 作用

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板的止血功能

内皮损伤(内皮下组织暴露) 血小板粘附 血小板初期释放 ADP等 血小板聚集 ADP

血小板的主要释放产物

类 别 活性胺 腺嘌呤核苷酸 阳离子 成分 5-HT,组胺,肾上腺素, 去甲肾上腺素 ADP,ATP,cAMP Ca2+, K+

血小板因子

PF3, PF4等 凝血因子I,V,VIII,XIII

β-TG,血小板糖蛋白等

血小板进一步激活、释放

血小板促凝作用 纤维蛋白形成

5-HT

凝血因子

血小板蛋白

血栓烷

TXA2

血块收缩

坚固的凝血块 第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板功能的实验室检查

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板粘附实验

原理

PAdT,玻珠柱法

血小板粘附试验(platelet adhension test,

PAdT)利用血小板在体外可黏附于玻璃表面的原理设 计,测定方法有多种,包括玻珠柱法、玻球法等。

当 血液与一定表面积的玻璃接触一定时间后,血小板粘 附于玻璃表面,因此血液中血小板数会降低。

通过计 数接触前、后的血中血小板数,即可计算出血小板粘 附率。

该试验为判断血小板粘附能力的常用指标。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PAdT 操作

?

将玻珠柱管(内径3mm,长9.4cm,内装直径0.3~ 0.5mm玻珠1.5g,管两端封以0.05cm孔径的尼龙布) 与注射器相连;

?

?

行肘正中静脉穿刺;

当血液接触玻珠时开始计时,掌握好血液通过玻珠柱 的速度。

在4等分的玻珠柱中,血液通过每段速度为 5s,共20s。

经过玻珠柱后,再按原速抽血5s; 采集通过玻珠柱前后的血液,作血小板计数。

?

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PAdT 参考区间

粘附前血小板数 - 粘附后血小板数 粘附前血小板数

血小板粘附率(%)=

×100%

参考值:62.5% ± 8.6 %

注意事项

取血过程必须顺利,掌握血液通过玻珠柱的速度。

待用玻珠柱应置于干燥器中储存,受潮后粘附率下降。

血小板计数要准确,宜作2~3次后取平均值。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PAdT 应用评价

血小板粘附率减低:见于先天性和继发性血小板功能异常(以后者多 见),如血管性血友病、巨大血小板综合征、爱-唐综合征、低 (无)纤维蛋白血症、异常纤维蛋白血症、急性白血病、骨髓 增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、肝硬化、尿毒症、服用抗 血小板药物等。

血小板粘附率增高:见于血栓前状态和血栓形成性疾病,如高血压病、 糖尿病、妊娠高血压综合征、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏 瓣膜置换术后、心绞痛、心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓形成、 口服避孕药等。

应用评价 是检测血小板功能的基本试验之一,用于遗传性与获得性 血小板功能缺陷疾病的诊断、血栓前状态和血栓性疾病检查以 及抗血小板药物治疗监测。

但特异性差,操作较复杂,易受较 多人为因素的影响,致使其在临床的实际应用受限。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板聚集实验

原理

PAgT

当一定数量的诱导剂存在时血小板即发生聚集。

以贫血小板血浆(PPP)设定最低浊度(100%透光 度),富血小板血浆(PRP)设定最高浊度(0%透光 度)。

在PRP血浆中加入诱聚剂诱导血小板聚集,测 定血浆浊度的变化,绘制血小板聚集曲线。

通过分析 血小板聚集曲线的最大聚集率(MAR)、达到最大幅 度的时间、达到1/2最大幅度的时间、2min的幅度、 延迟时间、斜率参数判断血小板的聚集的程度和速度。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PAgT 操作

1. 用硅化注射器从肘静脉取血4.5ml,注入含0.5ml 109mmol/L枸橼 酸钠的硅化或塑料离心管中,充分混匀;

2. 以1000r/min室温下离心10min,分离PRP,小心取出上层血浆, 计数血小板并调至(100~200)×109/L;

将上述剩余血液以3000r/min离心20min,分离PPP(上层较透明 的液体),血小板计数一般要求低于20×109/L; 3. 按照不同的聚集仪的要求,吸取所需的PRP和PPP置于比色杯中, 分别调整好透光度为10和0; 4. 打开记录仪走纸开关,描记10s的PRP基线,随后将适量诱聚剂 (视仪器要求而定,一般为反应体系总量的1/10左右)加入PRP中, 并开始搅拌,记录浊度改变曲线,测定时间一般为6~10min。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PAgT 参考区间

不同仪器及诱聚剂或者不同浓度、剂量的同种诱聚剂有不同的参考范围。

MG-196型血小板聚集仪为例,几种常用的诱聚剂测得的参考值:

ADP (1.0μmol/ml) 最大幅度(%) 达到最大幅度时间(S) 48.6 ~ 78.8 150 ~ 290 ADP (0.5μmol/ml) 25 ~ 50 68 ~ 230 肾上腺素 (4.0μg/ml) 50.2 ~ 85.6 220 ~ 360 胶原 (3.0μg/ml) 54 ~ 90 220 ~ 290 瑞斯托霉素 (1.5μmg/ml) 76.1 ~ 98.9 200 ~ 280

2min时幅度(%)

单峰或双峰曲线

38 ~ 68

双峰

20 ~ 42

双峰

25 ~ 50

双峰

22 ~ 61

单峰

55 ~ 90

双峰

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板聚集曲线

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PAgT 应用评价

应用评价 ? 本试验是检测血小板功能的基本试验之一,试验简便、快 速,成本低廉,在临床上开展比较广泛。

? 血小板聚集率减低:见于血小板无力症、血小板贮存池病、 血管性血友病、巨大血小板综合征、低(无)纤维蛋白原 血症、肝硬化、尿毒症、维生素B12缺乏症、细菌性心内 膜炎、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾 病、特发性血小板减少性紫癜、服用抗血小板药物等。

? 血小板聚集率增高血液高凝状态和(或)血栓形成性疾病, 如动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、肾小球肾炎、肾病综 合征、心脏瓣膜置换术后、深静脉血栓形成、高脂饮食、 口服避孕药和吸烟等。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PAgT 注意事项

标本采集后置于室温(25? C左右)下保存,并在3小时内完成 试验;

试验前至少1周应停用一切抑制血小板聚集的药物,如阿司匹 林、潘生丁、肝素、双香豆素等。

采血前一天应避免使用牛奶、豆浆等高脂肪食物以免影响悬 液透光度。

抗凝剂应选用枸橼酸钠,而忌用EDTA。

注意诱聚剂的保存,如ADP在保存过程中会自行分解产生AMP, 故配制后溶液应保存与-20? C冰箱,但保存一般不应超过6个月;肾 上腺素应避光防止减少分解。

此外,诱聚剂的种类和浓度对血小板 聚集结果都有影响,临床判断是应注明所用诱聚剂的种类和浓度。

各实验室也应建立自己的参考值。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板第3因子有效性测定(PF3aT

原理 PF3是血小板活化过程中形成的一种膜表面磷

脂成分(即磷脂酰丝氨酸),是血小板参与凝血过程 的重要因子。

试验将正常人与受检者的PRP(富含血小 板血浆)和PPP(贫血小板血浆)交叉组合,利用白陶 土作为血小板活化剂,氯化钙作为凝血反应启动剂, 促进PF3形成。

通过测定各组标本的凝固时间,比较 各组时差,了解受检者PF3是否有缺陷。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PF3aT 操作步骤

1. 2. 3. 采血,待测血样和正常对照血样各一份,加入抗凝剂混匀; 分别制备PPP和PRP; 准备四只试管,按下表加样;

组别 1 2 患者血浆(ml) PRP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 PPP 正常血浆(ml) PRP PPP 0.1

3

4

0.1

0.1

4. 5.

将上述4只试管置于37? C水浴预温2min后,依次加入白陶土悬液 0.2ml,并记录时间; 加入白陶土20min后,向小试管中依次加入0.025mol/L氯化钙 0.2ml,开动秒表测定凝固时间。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PF3aT 参考区间

第1组较第2组延长如超过5s以上,即为PF3有效 性减低。

第3组、第4组分别为患者和正常人(作为对

照管),患者PF3有缺陷或内源凝血因子有缺陷时

(如血友病),第3组凝固时间比第4组长。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

PF3aT 应用评价

应用评价 PF3aT是最常用的血小板凝血活性检测试 验,方法简单,易于操作。

? PF3有效性减低:见于先天性血小板PF3缺乏症、血小 板无力症、巨大血小板综合征、肝硬化、尿毒症、弥 散性血管内凝血、系统性红斑狼疮、特发性血小板减 少性紫癜、骨髓增生异常综合征、急性白血病及服用 抗血小板药物等。

? PF3有效性增加:常见于高脂血症、动脉粥样硬化、心 肌梗死、糖尿病伴血管病变等。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板膜糖蛋白测定

? 血小板膜糖蛋白(Glucoprotein,GP)是血小板功能和 血小板与其他活性物质作用的基础,一些糖蛋白如 GP Ia、 GP Ib、GP IIb、GP IIIa等已被确定为血小板特异抗原。

? GP 分子数量或结构异常均可导致出血或血栓形成。

? 活化血小板与静止血小板相比,GP 的种类、结构、含 量等亦呈现显著变化。

? 可使用ELISA或流式细胞术(FCM)分析血小板膜糖蛋白 的表达。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

主要血小板膜糖蛋白及功能

名 称 GP Ia GP Ib CD名称 CD49b CD42c 分子量 150 000 170 000 功能特性 与GP IIa形成复合物,是胶原的受体 与GP IX、GP V形成复合物,是vWF的受体,参与血 小板粘附反应,缺乏或减少时血小板粘附功能减低, 见于巨大血小板综合征 与GP II形成复合物,是层素(laminin)的受体 与GP Ia和Ic形成复合物,是胶原和层素的受体 GP IIb与IIIa形成复合物,是纤维蛋白原(Fg)的受 体,参与血小板聚集反应,缺乏或减少时血小板聚集 功能减低,见于血小板无力症 是TSP的受体 和GP Ib、GP IX构成vWF受体GP Ib-V-IX

GP Ic GP IIa GP IIb和 IIIa GP IV GP V

CD49f CD29 CD41a

140 000 138 000 IIb 145 000 IIIa 90 000 88 000 82 000

CD36

GP IX

P-selectin

CD42a

17 000

140 000

和GP Ib、GP V形成复合物,构成vWF受体

即α颗粒膜糖蛋白(GMP140)。

血小板活化时,可 移行至血小板将膜上,成为血小板活化的标志。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板自身抗体测定

血小板自身抗体包括:

血小板相关免疫球蛋白(platelet associated immunoglobulin, PAIg)(包括PAIgG、PAIgA、PAIgM) 特异性膜糖蛋白自身抗体

? ? ?

药物相关自身抗体 抗同种血小板抗体

血小板自身抗体测定表达有助于判断血小板减少的原因。

检测血小板免疫相关球蛋白的常用方法为ELISA及流式细 胞术。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板相关抗体测定的应用评价

?特发性血小板减少性紫癜(ITP):

90%以上的病人PAIgG增加,同时测定PAIgA、PAIgM及PAC3阳性率达100%。

ITP病人在皮质激素治疗后,PAIgG不下降可作为切脾的指征。

ITP疗效监测指标,治疗有效上述指标下降,复发则增加。

?其他疾病: 如同种免疫性血小板减少性紫癜(多次输血后)、 Evans

综合征、药物免疫性血小板减少性紫癜、慢性活动性肝炎、胶原性疾病、 系统性红斑狼疮、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤等 PAIg也可增加。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板寿命测定

原理 利用阿司匹林可使血小板花生四烯酸(AA)代

谢受阻,代谢产物丙二醛(MDA)和血栓烷B2(TXB2) 生成减少,而新生血小板不受抑制,MDA和TXB2含量正 常的原理,测量病人服用阿司匹林后血小板MDA和TXB2 生成量恢复曲线来推算血小板的生存时间。

该试验是检测血小板在体内破坏或消耗速度的一 项重要试验,也称为血小板生存时间测定(platelet survival time,PST)。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

血小板寿命测定的临床意义

血小板破坏增多性疾病,如: ITP、脾亢、SLE等

血小板生存 时间缩短见于

血小板消耗过多性疾病:DIC等 各种血栓性疾病,如:心梗、肺梗死等

注意:在血小板数过低时本法敏感性较低

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

第三节 血液凝固及检验

学习要点

?

了解血液中凝血因子及机体凝血机制的基础理论。

?

理解并掌握凝血因子实验室检查的临床应用及评

价。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

一、基本理论

凝血因子概述

?

14个:12个经典凝血因子 激肽释放酶原+高分子量激肽原

?

特殊:因子Ⅳ为钙离子(Ca2+),其余均为蛋白质 除因子Ⅲ即组织因子外,其余均存在于新鲜血浆中 依赖维生素K的凝血因子 :因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ

接触凝血因子 :因子Ⅻ、Ⅺ、激肽释放酶原及高分子量激肽原。

对凝血酶敏感的凝血因子 :因子Ⅰ、V、Ⅷ、ⅩⅢ

第十三章 第三节 血液凝固及检验

凝血因子一般特点

第十三章 第三节 血液凝固及检验

二、凝血机制

1.内源凝血途径 因子Ⅻ

因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ、Ca2+及PK、HMWK

因子Xa

固相激活:因子与带负荷的物质如体内的胶原、微纤维等以及体外的 玻璃、白陶土等接触后,构型发生改变而被激活为Ⅻa。

液相激活:因子Ⅻa在辅因子HMWK的参与下,水解PK使之被激活为K,

K又可反馈激活因子Ⅻ,生成大量的Ⅻa。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

二、凝血机制

2.外源凝血途径 因子Ⅲ

因子Ⅶ、Ca2+

因子Xa

(1)因子Ⅲ(TF) 是一种跨膜糖蛋白,作为因子Ⅶ的受体,可与因子 Ⅶ或Ⅶa结合,启动外源凝血途径。

(2)因子Ⅶ的激活 当TF结合到因子Ⅶ后,因子Ⅶ的构型发生改变随之 被凝血酶、Xa激活为Ⅶa。

因子Ⅶa与TF、Ca2+形成Ⅶ-TF- Ca2+复合物,其 形成所需时间很短,一般不超过10秒。

Ⅶ-TF- Ca2+复合物可激活因子X和 因子Ⅸ,使内源与外源凝血途径相联通,具有重要的生理和病理意义。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

二、凝血机制

3.共同途径

因子Ⅹ

纤维蛋白

(1)凝血活酶的生成 ① 因子X的激活:复合物Ⅶ-TF- Ca2+和Ⅸa-Ⅷa- Ca2+ -PF3均 可激活因子X生成有活性的因子Xa。

② 因子V的激活:在少量凝血酶的作用下,因子V被激活为Va。

③ 磷脂的作用:主要指血小板膜脂质双层中的磷脂酰丝氨酸 (PF3)。

它提供反应的催化表面。

上述因子共同作用形成Xa-Va- Ca2+ --PF3复合物,此即凝血 活酶(凝血酶原酶)。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

二、凝血机制

3.共同途径 (2)凝血酶的生成 在凝血活酶的作用下,凝血酶原被水解 释放出凝血酶原片段1和2(F1+2),变成凝血酶(因子Ⅱa)。

凝血酶是一种蛋白水解酶,其活性中心位于丝氨酸残基上,属 于丝氨酸蛋白酶类。

凝血酶在止血与凝血的生理和病理过程中 具有多种重要作用: ①水解纤维蛋白原;②激活因子Ⅷ、V、 Ⅶ、ⅩⅢ,称为凝血酶的自身催化作用;③激活血小板;④激 活抗凝系统的蛋白C;⑤抑制纤维蛋白(原)溶解活性。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

二、凝血机制

3.共同途径 (3)纤维蛋白的形成

① 可溶性纤维蛋白的形成:在凝血酶的作用下,纤维蛋白原的Aα链和Bβ 链先后被裂解,释出富含负电荷的纤维蛋白肽A(fibrinopeptide A,FPA) 和肽B(FPB)后,生成纤维蛋白单体(fibrin monomer,FM),它们因负 电荷减少,相互间排斥力明显降低,故能以氢键聚合。

这种聚合物很不稳 定,可溶于5mol/L(30%)尿素或1%单氯(碘)醋酸溶淮中(它们能解开 氢键),故称为可溶性纤维蛋白单体聚合物或可溶性纤维蛋白。

② 交联纤维蛋白的形成:在凝血酶的作用下,因子ⅩⅢ被激活为具有转谷 氨酰酶活性的XⅢa。

在因子XⅢa和Ca2+共同作用下,使FMγ链上的谷氨酸 与另一个FMγ链上的赖氨酸以共价键交联,形成稳定的纤维蛋白。

从内源凝血途径启动到纤维蛋白形成称为内源凝血系统,从外源凝血 途径启动到纤维蛋白形成称为外源凝血系统。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

二、凝血机制

第十三章 第三节 血液凝固及检验

凝血因子实验室检查 活化部分凝血活酶时间测定 ,APTT

原理 在抗凝血中,加入足够量的活化接触因子激活 剂(如白陶土)和部分凝血活酶(代替血小板的磷

脂),再加入适量的钙离子即可满足内源凝血的全部

条件。

从加入钙离子到血浆凝固所需的时间即称为活 化部分凝血活酶时间(activated partial

thromboplastin time, APTT)。

APTT的长短反映了

血浆中内源凝血系统凝血因子(Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ)、 共同途径中凝血酶原、纤维蛋白原和因子Ⅴ、Ⅹ的水

平。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

APTT 操作

(一)血凝仪法 1.预温活化 按仪器操作方法,取正常人混合血浆 0.1ml于测量杯中并加入APTT试剂0.1ml混匀,37℃ 准确孵育3min,其间轻轻摇动数次。

2.加钙计时 在测量杯中加入0.1ml 25mmol/L的CaCl2, 仪器自动测定混合物凝固的终点并显示正常人混合血 浆APTT秒数。

3.取待测血浆重复1~2的操作步骤,测定待测血浆的 APTT秒数。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

APTT 操作

(二)试管法 1.预温活化 加正常人混合血浆和APTT试剂各0.1ml于 塑料试管中混匀,37℃准确孵育3min,其间轻轻摇动 数次。

2.加钙计时 加入预温的0.1ml 25mmol/L CaCl2,混匀, 并立即开动秒表计时,置水浴中不断振摇。

20s后, 不时取出试管观察混合液流动状态(倾斜30°),当 液体停止流动时终止计时,记录其秒数。

一般应重复 测2~3次取平均值。

3.取待测血浆重复1~2的操作步骤,测定待测血浆 APTT秒数,一般应重复2~3次测定取平均值。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

APTT 参考区间

每个实验室应建立所用测定方法相应的参考区间。

男 性 (37±3.3)s , 范 围 为 31.5 ~ 43.5 s ; 女 性 (37.5±2.8) s ,范围为 32 ~ 43s 。

待测者测定值较 正常对照延长10s以上才有病理意义。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

APTT 注意事项

1.取血要顺利,血液应与抗凝剂充分混合避免发生微 小凝块,样品采集后在2h内完成测定。

2.样本测定前应测定正常人混合血浆,其APTT值在允许 的范围内方可测定样本。

3.APTT测定因所用的激活剂不同,以及部分凝血活酶来 源及制备的不同,均可影响测定结果。

部分凝血活 酶(磷脂)主要来源于兔脑组织(脑磷脂)。

不同 制剂质量不同,一般选用对因子Ⅷ:C、Ⅸ和Ⅺ在血 浆浓度为200~250U/L时敏感的试剂。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

APTT 临床意义

APTT是一个临床常用、较为敏感的检测内源凝血因子 缺乏的简便试验,已替代普通试管法CT测定。

但APTT对诊 断血栓性疾病(thrombotic disease)和血栓前状态 (prethrombotic state)缺乏敏感性,也无特异性,临床 价值有限。

新生儿由于凝血系统尚未发育完善,多种凝血因子尤 其是维生素K依赖凝血因子(FII、FVII、FIX、FX)和接触 系统凝血因子(FXI、FXII、PK、HMWK)血浆水平不到成人 的50%,其APTT检测将延长,一般出生后半年凝血因子可达 正常成人水平。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

APTT 临床意义

1.APTT延长 主要见于:① 轻型血友病,可检出FVIII活性 低于15%的患者,对FVIII活性超过30%和血友病携带者灵敏 度欠佳。

在中、轻度FVIII、FIX、FXI缺乏时,APTT可正常。

② vWD,Ⅰ型和Ⅲ型患者APTT可显著延长,但不少Ⅱ型患 者APTT并不延长。

③ 血中抗凝物如凝血因子抑制物、狼疮 抗凝物、华法林或肝素水平增高,FII、FI及FV、FX缺乏时 灵敏度略差。

④ 纤溶亢进,大量纤维蛋白降解产物(FDP) 抑制纤维蛋白聚合,使APTT延长,DIC晚期时,伴随凝血因 子大量被消耗,APTT延长更为显著。

⑤ 其他如肝病、DIC、 大量输入库血等。

2.APTT缩短 见于血栓前状态及血栓性疾病、DIC早期(动态 观察APTT变化有助于DIC的诊断)。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

APTT 应用评价

APTT对血浆肝素的浓度较敏感,是目前广泛应用的肝 素治疗监测指标。

此时,要注意APTT测定结果必须与肝素 治疗范围的血浆浓度呈线性关系,否则不宜使用。

一般在 肝素治疗期间,APTT维持在正常对照的1.5~3.0倍为宜。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

简易凝血活酶生成试验,STGT

原理 用受检者稀释全血作为本试验中所需的全部凝

血因子的来源,自身红细胞溶解产物即红细胞素代替 PF3,按一定时间加入正常基质血浆(提供凝血酶原 和纤维蛋白原),测定基质血浆的凝固时间,以检查 内源凝血系统凝血活酶生成有无障碍。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

STGT 操作

1.取受检者全血0.4ml注入5ml蒸馏水内,混匀,使其完 全溶解,此为溶血液。

2.取0.5ml溶血液加0.308mol/L氯化钠溶液0.5ml,混匀, 37℃预温2min,使其变为等渗液。

3.于上液中加已预温的0.025mol/L氯化钙溶液0.25ml, 启动秒表。

同时放一竹签以挑除形成的微量纤维蛋白丝。

此为温育混合液。

4.分别加0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml于6支大试管内, 置37℃水浴中,备用。

5.在1min45s时,吸0.1ml温育混合液注入第1支含有氯化 钙溶液的试管内;在准2min时,将已预温的正常基质血 浆0.1ml也加至第1支试管内,启动第2个秒表,记录凝 固时间。

每隔2min重复以上步骤1次,共6次。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

STGT 参考区间

以最短的凝固时间作为本试验中最有价值的计数。

正 常人为(11.99±0.72)s,>15 s为异常。

注意事项 1.等渗化的血液不宜放置过久。

2.温育混合液的准备要严格记时。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

STGT 临床意义

STGT 延 长( >15 s ), 主要见于: ① 先天性因子 VIII、IX、XI缺乏;② 获得性因子VIII、IX、XI缺乏, 如 DIC 、原发性纤溶以及肝脏疾病、维生素 K 缺乏症等; ③ 血循环中有抗凝物质,如肝素、口服抗凝剂以及其他 抗凝物质等。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

STGT纠正试验

原理 在STGT延长的受检稀释全血血液中分别加入1/100容量 的正常 BaSO4 吸附血浆(提供FⅧ、Ⅺ、Ⅻ)正常血清 (Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ)和正常新鲜血浆(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ), 分别测定正常基质血浆的最短凝固时间,以确定内源性 凝血活酶生成缺陷的因子。

操作 1.取小试管3支,分别加入正常吸附血浆、正常血清、正 常新鲜血浆各0.005ml。

2.于上述3支试管中,再各加受检溶血液0.5ml,再加 0.308mol/L氯化钠溶液0.5ml,混匀,37℃水浴2min。

3.按测定STGT的第3~5步骤继续操作。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

STGT纠正试验

参考区间 加入各种纠正血浆或血清后,延长时间纠正到正常范 围之内(即10~15s)。

注意事项 1.吸附血浆制备时以0.1mol/L草酸钠抗凝为好。

2.正常血浆、血清和吸附血浆需新鲜制备。

临床意义 本试验敏感性较差,尤其对因子XI、IX的缺乏评价更 低,应以凝血因子活性检测来替代。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

STGT 临床意义

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定

原理 受检者稀释血浆分别与缺乏因子II:C、V:C、VII: C、X:C的基质血浆混合,再加兔脑粉浸出液和钙溶液, 作凝血酶原时间测定。

将测得的结果与正常人新鲜混合血 浆作比较,分别计算受检血浆中所含因子II:C、V:C、 VII:C、X:C相当于正常人的百分率。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定 操作 1.取至少30人份正常人的血浆混合,以生理盐水作1:10、1: 20、1:40、1:80、1:160稀释,其中以1:10稀释作为100% 的促凝活性。

2.取各稀释标本0.1ml、缺乏因子的基质血浆0.1ml、兔脑或 人脑浸出液0.1ml相加并混匀,37℃水浴温育30S后,加入预 温的25mmol/L CaCl2溶液0.1ml,在37℃水浴中摇动,记录凝 固时间。

3.以所测凝固时间(S)为纵坐标,稀释标本浓度为横坐标 绘制标准曲线或建立回归方程。

4.受检血浆用生理盐水作1:20稀释后,按上述操作取得凝 固时间,通过标准曲线或回归方程,得出相当于正常人因子 活性的百分比,将该值再乘以2,即为受检血浆凝血因子活性 的水平相当于正常人的百分率(%)。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定 参考区间

FII:C:97.7%±16.7%

FV:C:102.4%±30.9%

FVII:C:103.0%±l7.3% FX:C:103.0%±l9. 0% 注意事项 1.样品采集后应在2h内完成测定,或分离血浆后置于-80℃ 冰箱中,2~3个月内检测并避免反复冻融。

2.标准曲线绘制时数据可以用半对数或双对数处理。

3.缺乏因子的基质血浆应保证相应凝血因子的活性少于1%, 而其他因子水平正常。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定 临床意义

1.活性增高

主要见于血栓前状态和血栓性疾病。

2.活性减低 见于先天性因子II 、V 、VII 、X 缺 乏症,但较少见。

获得性减低者见于维生素K 缺 乏症、肝脏疾病(最多和最先减少的是因子VII, 其次和中度减少的是因子II和X ,最后和最少减 少的是因子V)、DIC 和口服抗凝剂等。

在血循环 中有上述凝血因子的抑制物时,这些因子的血浆 水平也减低。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定 应用评价

目前因子II:C、V:C、VII:C、X:C的测定主要 用于肝脏受损的检查,因子VII:C下降在肝病的早 期即可发生;因子V:C的测定在肝损伤和肝移植中 应用较多。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子VIII、IX、XI、XII促凝活性测定

原理 待测血浆分别加入乏FⅧ、FⅨ、FⅪ和FⅫ基质血浆、 白陶土-脑磷脂悬液和钙离子溶液,进行APTT测定。

将正 常人混合血浆与乏因子血浆混合,测定APTT,作出标准曲 线。

从各自的标准曲线中分别计算出受检血浆中FⅧ:C、 FⅨ:C、FⅪ:C和FⅫ:C相当于正常人的百分率(%)。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子VIII、IX、XI、XII促凝活性测定 操作

1.空白管测定 取基质血浆、咪唑缓冲液、脑磷脂悬液及5 g/L白陶土生 理盐水悬液各0.1ml,混匀,37℃水浴2min,加预温的0.05mol/L氯化钙溶 液0.1ml,记录凝固时间。

要求空白管测定时间控制在240s~250s,其时 间的长短可以用脑磷脂的浓度来调节。

2.标准曲线绘制 正常人新鲜混合血浆以咪唑缓冲液作1:10、1:20、1: 40、1:80、1:160稀释。

将各稀释混合血浆0.1ml、各种乏因子Ⅷ、Ⅸ、 Ⅺ、Ⅻ的基质血浆0.1ml、脑磷脂悬液0.1ml和5g/L白陶土生理盐水悬液 0.1ml混匀,37℃水浴温育2min后,加入预温的0.05mol/L CaCl2溶液 0.1ml,在37℃水浴中摇动,记录凝固时间。

以1:10稀释的标本为100%促 凝活性,稀释度对数作横坐标,凝固时间对数作纵坐标,在双对数曲线上 绘制曲线或计算回归方程。

3.受检标本测定 取置于冰浴中的受检血浆以咪唑工作液作1:20稀释后, 按上述操作取得凝固时间,通过标准曲线或回归方程,得出各因子活性再 乘以2,即为受检血浆凝血因子活性的水平相当于正常人的百分率(%)。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子VⅢ、IX、XI、XII促凝活性测定 参考区间

FVⅢ:C:103.0%±25.7%;FIX:

C:98.1%±30.4%; FXI:C:100.0%±18.4%;FXII:C:92.4%±20.7%。

注意事项 1.缺乏某因子的基质血浆应保证相应凝血因子的活性少于1%,而其它因 子水平正常。

2.样品采集后应在2h内完成测定,或分离血浆后置于-80℃冰箱中,2~ 3个月内检测并避免反复冻融。

3.受检标本检测凝固时间不在标准曲线范围可稀释后检测。

4.所有标本包括正常新鲜混合血浆检测前都应放置在冰水浴中。

5.每次测定都应做标准曲线。

至少选择30人以上制备正常新鲜混合血 浆,冻干-80℃可保存3个月以上。

可用商品化的APTT试剂代替脑磷脂 悬液和白陶土生理盐水悬液,但浓度需另做调整。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子VIII、IX、XI、XII促凝活性测定 临床意义

FⅧ:C在急性时相反应时可明显升高,在严重肝实质损伤时,FⅧ:C 可明显升高。

FⅧ:C减低时,需与vWF含量同时测定,以筛选出vWF 缺陷的可能。

1.增高 血浆中凝血因子VⅢ:C、IX: C、XI:C水平增高,主要见于血 栓前状态和血栓性疾病,如静脉血栓形成、肺栓塞、妊娠高血压综 合征、晚期妊娠、口服避孕药、肾病综合征、恶性肿瘤等。

肝病时, 因子VⅢ:C增高。

2.减低 因子VⅢ:C减低见于血友病甲(其中重型≤1%;中型2%~5%; 轻型6%~25%;亚临床型26%~45%)、血管性血友病(尤其是I型和 Ⅲ型)、DIC、血中存在因子VⅢ抗体(此情况少见)。

因子IX:C减 低见于血友病乙(临床分型同血友病甲)、肝脏疾病、DIC、VitK 缺乏症、口服抗凝剂及抗IX因子抗体存在等。

因子XI:C减低见于XI 因子缺乏症、DIC、肝脏疾病以及抗XI因子抗体存在等。

因子XⅡ:C 减低见于先天性因子XⅡ缺乏症、DIC、肝脏疾病以及部分血栓病患 者。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

凝血因子XⅢ定性试验

原理 在钙离子作用下,因子XⅢ能使溶于尿素或单氯乙 酸的可溶性纤维蛋白单体聚合物转变为不溶性的纤维蛋白 凝块,不再溶于尿素或单氯乙酸溶液。

如受检血浆中缺乏 因子XⅢ,则血浆凝块可再行溶解。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

凝血因子XⅢ定性试验 操作

1.受检血浆0.1ml, 加0.025mol/L CaCl2溶液0.1ml,混合后 置37℃水浴。

2.待凝块形成后,取出检测试管,尽量去除管中液体,移入 5mol/L尿素或10g/L单氯乙酸溶液5ml,置37℃水浴。

3.先每15min观察1次,共2h,以后每2~4h观察1次,共24h。

参考区间 24h内纤维蛋白凝块不溶解。

注意事项 1.钙离子溶液需新鲜配制,防止假阴性结果。

2.凝块加入5mol/L尿素或10g/L单氯乙酸溶液后,应使其悬浮 于溶液中。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

凝血因子XⅢ定性试验 应用评价

本试验简单、可靠,是十分实用的过筛试验。

在 临床上若发现伤口愈合缓慢、渗血不断或怀疑有凝血 因子XIII缺陷者,均可首先选择本试验。

若纤维蛋白凝块在24h内,尤其2h内完全溶解,表 示因子XIII缺乏,见于先天性因子XIII缺乏症和获得 性因子XIII明显缺乏,后者见于肝病、SLE、DIC、原 发性纤溶症、转移性肝癌、恶性淋巴瘤以及抗FXIII抗 体存在等。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子XⅢ亚基抗原测定

原理 免疫火箭电泳法:凝血因子ⅩⅢ由α和β两个亚基 构成。

在含有FⅩⅢα亚基和β亚基抗血清的琼脂凝胶板 中,加入受检血浆(抗原),在电场作用下,出现抗原抗体反应形成的火箭样沉淀峰,此峰的高度与受检血浆中 FⅩⅢ亚基的浓度成正比。

根据沉淀峰的高度,从标准曲 线中计算出FⅩⅢα:Ag和FⅩⅢβ:Ag相当于正常人的百 分率。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子XⅢ亚基抗原测定 操作

1.制板 (1)将1%琼脂糖煮沸溶解后置于50~56℃水浴中 备用;(2)取一只小烧杯,根据抗血清的效价,进行适当调 整,按每次试验所需量加入抗因子ⅩⅢα、抗ⅩⅢβ亚基血 清,充分混匀,尽量避免气泡;(3)取10cm×10cm玻璃板两 块,中间放入有机玻璃框,三边用夹子固定,于上口迅速倒 入含抗血清的琼脂糖,每板加10ml左右,4℃冰箱中10~ 15min,凝固后除去一块玻璃板,在距玻璃板下缘1.5cm处打 10个孔,孔径3mm,孔距5mm。

2.标准品制备 取30例正常人新鲜血浆或冰冻混合血浆,并 用Tris-巴比妥缓冲液作1:2、1:4、1:8、1:16稀释。

3.受检标本制备 将受检血浆用Tris-巴比妥缓冲液作1:2 稀释。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子XⅢ亚基抗原测定 操作

4.加样 每孔加入受检样品10μl,每板均同时各加上述5种 不同稀释度的标准品10μl,制作标准曲线。

5.电泳 (1)每侧电泳槽内加入Tris-巴比妥缓冲液约 500~1000ml,两槽的液面应一致;(2)将玻璃板放在两槽 之间,孔朝向阴极,火箭方向朝阳极,用两层滤纸搭桥,电 桥间距为5.3cm左右;(3)调节电压至于110V,电泳18h。

6.染色 电泳完毕,取出玻璃板,浸入1%磷钼酸溶液中20~ 30min。

7.测定火箭电泳高度 用两分规从加样孔上缘至顶峰测量火 箭峰高度。

8.计算 用标准血浆的5个数值绘制标准曲线或回归方程, 求出各测定样品的含量,再乘以稀释倍数2,得到因子ⅩⅢα: Ag、ⅩⅢβ:Ag相当于正常人的百分含量。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

血浆因子XⅢ亚基抗原测定 操作

参考区间 FXⅢα:100.4%±12.9%;FXⅢβ:98.8%±12.5%。

注意事项 1.根据抗体效价,选择抗体与抗原结合良好的稀释倍数。

2.每次检测均应做标准曲线。

临床意义 1.先天性因子XⅢ缺乏症 纯合子型者的FXⅢα:Ag明显减 低(≤1%),FⅢβ:Ag轻度减低;杂合子型者的FⅢα:Ag 减低(常≤50%),FⅢβ:Ag正常。

2.获得性因子XⅢ减少症 见于肝疾病、DIC、原发性纤溶 症、急性心肌梗死、急性白血病、恶性淋巴瘤、免疫性血小 板减少性紫癜、SLE等。

一般认为,上述疾病的因子 XⅢα:Ag有不同程度的降低,而因子XⅢβ:Ag正常。

第十三章 第三节 血液凝固及检验

第四节 抗凝物质及检验

学习要点

?

了解抗凝物质如抗凝血酶、蛋白C系统、组织因 子途径抑制物等的基本理论。

?

理解并掌握抗凝物质实验室检查的临床应用及评 价。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

一、基本理论

抗凝血酶概述

?抗凝血酶(antithrombin,AT)是一种单链糖蛋白,由

肝、血管内皮细胞和巨核细胞合成,属于α2球蛋白。

?AT作用:AT是肝素依赖的丝氨酸蛋白酶抑制物,抑酶谱 很广,能抑制FⅡa、FVⅡa、FIXa、Fxa、FXⅡa以及纤溶 酶、胰蛋白酶和激肽释放酶等,作用机制相同。

?AT作用机制:肝素与AT结合后,导致AT构型发生改变, 后者可与这些酶活性中心的丝氨酸残基结合,“封闭” 了这些酶的活性中心而使之失活。

此时肝素可从复合物 中重新释出,再与其他游离的AT结合,继续发挥肝素增 强AT抗凝功能的作用。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

一、基本理论

蛋白C概述

?蛋白C系统包括蛋白C(protein

C,PC)、凝血酶调节蛋 白(thrombomodulin,TM)、蛋白S(protein S,PS)、 活性蛋白C抑制物(activated protein C inhibitor,APCI)和内皮细胞蛋白C受体(endothelial protein C receptor,EPCR)。

?蛋白C、蛋白S、APCI由肝脏产生,TM和EPCR由内皮细胞 产生和表达。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

一、基本理论

蛋白C概述

?APC作用机制:蛋白C被凝血酶与凝血酶调节蛋白复合物

激活形成活化的蛋白C(APC),这一过程在EPCR辅助下 完成。

APC在蛋白S的协同下,发挥抗凝作用,主要表现 在裂解因子Va、Ⅷa,抑制因子Xa与血小板膜磷脂的结合。

?APCI作用机制:APCI通过和APC结合使之失去灭活因子 Va、Ⅷa的作用。

如果蛋白C或蛋白S有缺陷,与AT缺陷一 样(它们均有遗传性缺陷),可引起机体凝血和抗凝平 衡失调,导致血栓形成。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

一、基本理论

TFPI概述

?组织因子途径抑制物(tissue

factor pathway inhibitor,TFPI)是一种单链糖蛋白,主要由血管内皮 细胞、血小板、单核细胞等合成和分泌。

?TFPI在血浆中以与脂蛋白结合和游离两种形在存在。

?TFPI作用机制:TFPI存在于Ⅶa和Ⅹa的结合部位,通过 和TF-Ⅶa复合物结合抑制其活性,从而对组织因子凝血 途径发挥重要调控作用。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

一、基本理论

生理性和病理性抗凝物质概述

?生理性抗凝物质包括肝素辅因子Ⅱ(hepauin

cofactorⅡ,HCⅡ)、a2-巨球蛋白(a2-macroglobulin, a2-MG)和a1-抗胰蛋白酶(a1-antit-rypsin,a1-AT)等。

?病理性抗凝物质主要包括肝素及类肝素物质、狼疮抗凝 物(lupus anticoagulation, LAC)、凝血因子抑制物 等。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

抗凝物质的实验室检查

抗凝血酶抗原含量测定 ,AT:Ag

原理 以抗凝血酶(AT)抗体包被酶标反应板,标本

中的AT与固相的抗AT抗体相结合,再加入酶标抗AT抗

体,则形成抗体-抗原-酶标抗体的复合物,加入显色 基质后,根据显色程度来判断标本中的AT含量。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

AT:Ag 操作

1.用碳酸盐缓冲液将抗AT单抗配制为适当浓度,加入 到酶标板中,0.1ml/孔,4℃过夜。

2.洗涤液洗去未结合的单抗。

3.将经样品稀释液系列稀释的标准品及待测标本加入 含固相抗体的酶标板中,0.1ml/孔,37℃温育2h后, 洗涤液洗涤3次。

4.每孔加0.1ml适当浓度的酶标抗AT抗体,37℃再温育 2h,洗涤液洗涤3次。

5.加新鲜配制的邻苯二胺、3%过氧化氢的枸橼酸盐缓 冲液,0.1ml/孔,显色10min。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

AT:Ag 操作

6.每孔加0.05ml 3mol/L硫酸溶液终止反应。

7.酶标仪上492nm波长测各孔吸光度值。

8.以标准品的浓度为横坐标,其对应的吸光度值为纵 坐标,在半对数纸上绘制标准曲线或计算回归方程。

9.以待测样品的吸光度值从标准曲线或回归方程查出 相应的数值,再乘以稀释倍数,即为样品中AT抗原的 含量。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

AT:Ag 操作

参考区间 AT抗原 (290 ± 30.2) mg/L 注意事项 1.所有标本不能用肝素抗凝。

2.待检血浆及标准品从冰箱取出后应立即置37℃水浴中 解冻,并避免反复冻融。

3.每次测定时需做标准曲线,最好做复孔。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

AT:Ag 应用评价

AT抗原和AT活性以同时测定为好。

两者临床意义相 似,但不一定平行,尤其在先天性AT缺陷时,并非AT合 成量的减少,而是合成了结构异常的AT分子,测其抗原 量正常,而活性减低。

1.AT抗原水平减低 见于先天性AT缺陷;但更常见于获 得性AT缺陷,如肝脏病变、DIC、血栓性疾病、妊高症等。

2.AT抗原水平增高 可见于血友病、口服抗凝剂治疗、 黄体酮应用以及某些血管性疾病等。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

蛋白C抗原测定 PC:Ag

原理 以抗蛋白C(PC)抗体包被酶标反应板,标本中

的PC与固相的抗PC抗体相结合,再加入酶标抗PC抗体, 则形成抗体-抗原-酶标抗体的复合物,加入显色基质 后,根据显色程度来判断标本中的PC含量。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

PC:Ag 操作

1.用碳酸盐缓冲液将抗PC单抗配制为适当浓度,加入到 酶标板中,0.1ml/孔,4℃过夜。

2.洗涤液洗去未结合的单抗。

3.将经样品稀释液系列稀释的标准品及待测标本加入含 固相抗体的酶标板中,0.1ml/孔,37℃温育2h后,洗涤 液洗涤3次。

4.每孔加0.1ml适当浓度的酶标抗PC抗体,37℃再温育2h, 洗涤液洗涤3次。

5.加新鲜配制的邻苯二胺、3%过氧化氢的枸橼酸盐缓冲 液,0.1ml/孔,显色10min

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

PC:Ag 操作

6.每孔加0.05ml 3mol/L硫酸溶液终止反应。

7.酶标仪上450nm波长测各孔吸光度值。

8.以标准品的浓度为横坐标,其对应的吸光度值为纵坐 标,在半对数纸上绘制标准曲线或计算回归方程。

9.以待测样品的吸光度值从标准曲线或回归方程查出相 应的数值,再乘以稀释倍数,即为样品中PC抗原的含量。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

PC:Ag 操作

参考区间 PC抗原 (2.7~5.6) mg/L 注意事项 1.标本采集后及时检测,如有特殊原因,须将标本及时分装 后放在-20℃或-70℃条件下保存,并避免反复冻融。

2.每次测定时需做标准曲线,最好做复孔。

3.标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此 项检测。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

PC:Ag 临床意义

人体内血浆PC含量随年龄而增加,每10年约增加4%。

1.PC抗原水平减低 见于先天性蛋白C缺陷和获得性蛋白 C缺陷,如肝脏疾病、手术后、弥散性血管内凝血、 成人型呼吸窘迫综合征等。

2.PC抗原水平增高 见于血栓性疾病和血栓前状态,如 弥散性血管内凝血、深部静脉血栓形成、缺血性心脏 病、急性心肌梗死、心绞痛、糖尿病、肾病综合征、 妊娠后期等。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

蛋白S抗原测定

原理 Laurell火箭电泳法:血浆总PS(TPS)包括

游离PS(FPS)和与补体C4结合的PS(C4bP-PS),火 箭电泳法可在琼脂板上同时测定TPS和FPS。

在待测血 浆中加一定量聚乙二醇6000,可沉淀C4bPS,上清部 分即为FPS。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

PS 操作步骤

1.制板 (1)将1%琼脂糖煮沸溶解后置于50~56℃水浴中备用;(2) 取一只小烧杯,根据抗血清的效价,进行适当调整,按每次试验所需 量加入抗人PS血清,充分混匀,尽量避免气泡;(3)取10cm×10cm 玻璃板两块,中间放入有机玻璃框,三边用夹子固定,于上口迅速倒 入含抗血清的琼脂糖,每板加10ml左右,4℃冰箱中10~15min,凝固 后除去一块玻璃板,在距玻璃板下缘1.5cm处打一排加样孔,孔径2mm, 孔距3mm。

2.标准品制备 取30例正常人新鲜血浆或冰冻混合血浆,并用Tris-巴 比妥缓冲液作原倍(100%)、1:2(50%)、1:4(25%)、1:8 (12.5%)、1:16(6.25%)稀释。

3.加样 每孔加入受检样品10μl,每板均同时各加上述5种不同稀释 度的标准品10μl,制作标准曲线。

4.电泳 (1)每侧电泳槽内加入Tris-巴比妥缓冲液500~1000ml,两 槽的液面应一致;(2)将玻璃板放在两槽之间,加样孔朝向阴极, 火箭电泳走向向朝阳极,用两层滤纸搭桥,电桥间距为5.3cm左右; (3)调节电压至于110V,电泳18h。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

PS 操作步骤

5.染色 电泳完毕,取出琼脂板,浸入1%磷钼酸溶液中20~30min,可 见清晰的火箭电泳沉淀峰。

6.测定火箭电峰高度 用两分规从加样孔上缘至顶峰测量火箭峰高度。

7.计算 用标准血浆的5个数值绘制标准曲线或回归方程,求出各测定 样品的PS含量。

8.FPS 取2支试管,各含300μl标准参比血浆,每支试管加25%聚乙二 醇-6000 50μl,充分混匀,室温放置30min,3000r/min离心10 min, 取上层血浆。

一支作为原倍(100%),另一支作1:2(50%)、1:4 (25%)、1:8(12.5%)和1:16(6.25%)稀释。

其余操作同TPS测 定。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

PS 参考区间

TPS:96.6%±9.8%;FPS:100.9%±11.6%。

注意事项 1.FPS的制备中要注意加入25%聚乙二醇-6000后要充 分混匀,并在室温下维持30min后再离心取上清, 且必须在4h内完成加样上槽的工作,否则会影响实 验结果。

2.同一份标本,同时做TPS和FPS,加样时可以单孔 为TPS样本,双孔为FPS样本,以便分析结果。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

PS 临床意义

1.PS缺陷患者易出现血液高凝状态,先天性PS缺陷 患者常伴发严重的深静脉血栓栓塞。

2.获得性PS缺陷常见肝脏疾病,如急性肝炎、慢性 活动性肝炎、肝硬化、VitK缺乏症、急性呼吸窘 迫综合征等。

口服抗凝药、口服避孕药时,PS降 低。

妊娠及新生儿PS偏低。

第十三章 第二节 血小板止血作用及检验

组织因子途径抑制物抗原检测,TFPI:Ag

原理 间接ELISA法:用纯化的人组织因子途径抑制物(TFPI)抗

体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入已 知浓度的组织因子途径抑制物(TFPI)标准品和未知浓度的TFPI待

检样品,温育后,加入生物素标记的抗TFPI单体作为检测抗体

(第二抗体),再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物,经 过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的组织 因子途径抑制物(TFPI)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定 吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人组织因子途径抑制 物(TFPI)浓度。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

TFPI:Ag 操作步骤

1.枸橼酸钠抗凝血4000r/min,15min分离血浆立即检测, 或-20℃以下保存,用前置37℃ 15min使之充分融解后, 以样本缓冲液按1:20稀释。

以样品缓冲液将TFPI参考血 浆作1:20稀释作为参考对照。

2.已包被抗TFPI单抗的微孔板,每孔加0.1ml不同浓度的 TFPI标准液(5、2.5、1.25、0.625ug/L)。

TFPI参考血 浆与稀释的标本(待测血浆)加入孔内,每份加2孔。

加 盖,4℃过夜。

3.洗涤缓冲液洗板4次。

4.每孔加0.1ml抗TFPI检测抗体,加盖,室温1h。

5.洗涤缓冲液洗板4次。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

TFPI:Ag 操作步骤

6.将酶联物0.01ml加入酶联物稀释液11ml。

每孔加经稀释 的酶联物0.1ml,加盖,室温1h。

7.洗涤缓冲液洗板4次。

8.每孔加TMB溶液0.1ml,轻叩使之混匀,避光显色15min。

9.每孔加0.05ml硫酸溶液终止反应。

10.酶标仪上450nm波长测各孔吸光度值。

11.以标准品的浓度为横坐标,其对应的吸光度值为纵坐标, 在半对数纸上绘制标准曲线或计算回归方程。

12.以待测样品的吸光度值从标准曲线或回归方程查出相应 的数值,再乘以稀释倍数,即为样品中TFPI抗原的含量。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

TFPI:Ag 参考区间

(97.5±26.6)μg/L 注意事项 1.本法测定的是TFPI总量,包括与HDL、LDL、VLDL 结合的和游离的TFPI以及保留有Kunitz-1的TFPI 裂解片断。

2.使用肝素可提高TFPI与Xa和VIIa结合的能力,并 促使血管内皮细胞合成TFPI,引起血浆中TFPI增 加。

3.比色应在30min内测毕。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

TFPI:Ag 临床意义

老年人、妊娠期、致死性败血症、 慢性肾衰减等

增高

减少

大手术、脓毒血症、DIC等

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

组织因子途径抑制物活性检测

原理 待测样品用TF/FVIIa和FX温育后,TF/FVIIa复

合物的剩余活性可用高度特异性的发色底物S-2222来 反映,仅检测由FXa裂解出的发色基团对硝基苯胺 (pNA)。

测定反应液中pNA在波长405nm处的吸光度 值,由已知TFPI活性制得的标准曲线,得出TFPI活性。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

组织因子途径抑制物活性检测

原理 待测样品用TF/FVIIa和FX温育后,TF/FVIIa复

合物的剩余活性可用高度特异性的发色底物S-2222来 反映,仅检测由FXa裂解出的发色基团对硝基苯胺 (pNA)。

测定反应液中pNA在波长405nm处的吸光度 值,由已知TFPI活性制得的标准曲线,得出TFPI活性。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

组织因子途径抑制物活性检测 操作步骤

1.样本处理 枸橼酸钠抗凝血浆,56℃水浴15 min,置冰 水中冷却2min,以1000r/min离心3min,收集上清液,冻 存。

用前以缓冲液1:50稀释。

2.标准曲线制备 加热处理健康人混合血浆,分别取0.125、 025、0.5、1.0、2.0、4.0μl,补加缓冲液至50 μl。

以 1μl含TFPI为1U/ml,则相应各管分别为0.125、0.25、 0.5、1.0、2.0、4.0U/ml。

在双对数图上以各管TFPI值为 横坐标,相应各管的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线或计 算回归方程。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

组织因子途径抑制物活性检测 操作步骤

3.样品测定 稀释的样品50μl和100μl的反应体系(等体 积下列溶液:0.125ml/L人因子VIIa,0.025U/ml牛因子X, 人脑凝血活酶,75mmol/L氯化钙)混合,37℃ 10min。

4.每孔加25μl 0.4U/ml因子X,37℃ 10min。

5.加入2g/L S-2222,37℃ 20min。

6.加入50%醋酸100μl终止反应。

7.酶标仪上405nm波长测各孔吸光度值,从标准曲线或回归 方程得到TFPI值。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

组织因子途径抑制物活性检测 操作步骤

参考区间 (0.97~1.35)U/ml 注意事项 1.样本处理时,要保证其温度、离心速度及时间的 精准。

2.标本避免使用肝素抗凝。

临床意义 同TFPI抗原测定。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

凝血酶时间测定 ,TT

原理 凝血酶可使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。

在血浆

中加入“标准化”的凝血酶后,血浆凝固所需时间称 为凝血酶时间。

方法 1.取抗凝血浆0.1ml于小试管内,置37℃水浴中,加凝血 酶溶液0.1ml,同时开动秒表,记录凝固时间。

2.以同样方式测定受检血浆,重复2-~3次,求平均值。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

TT 参考区间

正常为16~18s,超过正常对照3s为异常。

注意事项 1.血浆在室温下放置不能超过3h,EDTA盐和肝素抗 凝血不宜做本试验。

2.已稀释配制好的凝血酶溶液不能久置室温下,在 4℃环境下可保存3天。

3.TT终点以出现混浊的初期凝固为准。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

TT 临床意义

使用链激酶、尿激酶作溶栓治疗时,TT可作为监护指 针,当患者的TT为同时测定的正常对照值的1.5~2.5倍 时,提示溶栓治疗有效。

1.TT延长 见于肝素增多或类肝素抗凝物质存在,如 SLE、肝病、肾病等;低(无)纤维蛋白原血症、FDP增多、 DIC等。

2.TF缩短 主要见于某些异常蛋白血症或巨球蛋白血症 时,此外,较多的是技术原因,如标本在4℃环境中放置 过久,组织液混入血浆等。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

凝血酶时间纠正试验(甲苯胺蓝纠正试验

原理

甲苯胺蓝可中和肝素的抗凝作用,当凝血酶时间延长,

可向受检血浆中加入甲苯胺蓝,若延长的凝血酶时间 恢复正常,则表示肝素或类肝素增多,否则为其他抗 凝血酶类物质。

方法

1.受检血浆0.1 ml,加0.1%甲苯胺蓝0.1 ml混匀, 置37℃水浴。

2.立即加入凝血酶溶液0.1 ml,记录凝固时间,重 复2~3次,取均值。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

TT纠正试验 参考结果

加甲苯胺蓝后TT明显缩短,与未加甲苯胺蓝的TT 比较相差5s以上,视为纠正,否则提示TT延长不是由 于肝素类物质所致。

注意事项 1.血浆在室温下放置不能超过3h,EDTA盐和肝素抗 凝血不宜做本试验。

2.已稀释配制好的凝血酶溶液不能久置室温下,在 4℃环境下可保存3天。

3.纤维蛋白原含量过低时,甲苯胺蓝颜色可干扰凝 固结果判断,应特别注意。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

TT纠正试验 临床意义

1.TT延长并可被甲苯胺蓝纠正,表明受检者血循环中存 在肝素或类肝素物质,可见于肝素治疗时、放疗后、过敏 性休克、SLE、DIC、肝叶切除后等。

2.TT延长,加入甲苯胺蓝不能纠正者,提示延长的凝血 酶时间不是因为肝素类物质增多所致,可能存在其他抗凝 血酶类物质,包括FDP增高。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

普通肝素和低分子量肝素测定

原理 抗凝血酶(AT)可抑制凝血酶及Xa,但在正

常情况下,其抑制作用较慢。

当肝素与AT结合形成1: 1的复合物,该复合物灭活因子Xa的作用大大加强; 低分子量肝素对AT和FXa间反应的催化作用较其对AT 和凝血酶间反应的催化更容易,而标准肝素对两者的 催化作用相同。

在AT和 FXa均过量的反应中,肝素对 FXa的抑制速率直接与其浓度成正比,用特异性FXa发 色底物法检测剩余FXa的活性,发色强度与肝素浓度 呈负相关。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

普通肝素和低分子量肝素测定 操作步骤

1.半微量测试法 200μlAT,加25μl血浆样品或肝素标准 品,混匀,37℃温育2min,加200μl FXa,混匀,37℃精 确温育1min;混合液中加200μl发色底物Spectrozyme FXa,混匀,37℃精确温育5min;加200μl醋酸,混匀; 最后,加200μl水。

在波长405nm处读取吸光度值,空白 对照液可按下列顺序配置: 200μl醋酸→200μlAT→25μl正常对照血浆→200μl FXa→200μl发色底物Spectrozyme FXa→200μl水。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

普通肝素和低分子量肝素测定 操作步骤

2.微量板法 以200μl生理盐水稀释100μl标准品或受检 血浆,配成1:2稀释的肝素标准品或受检血浆。

微孔中加 75μl AT,随后加25μl 1:2稀释的血浆样品或肝素标准 品,混匀,37℃温育2min,加75μl FXa,混匀,37℃温 育1min;混合液中加75μl发色底物Spectrozyme FXa,混 匀,37℃温育5min;加75μl醋酸,在波长405nm处读取吸 光度值,空白对照液可按下列顺序配置: 75μl醋酸→75μl AT→25μl稀释的正常对照血浆或受检 血浆→75μl FXa→75μl发色底物Spectrozyme FXa。

3.制备标准曲线或回归方程 以吸光度值与对应的肝素标 准品浓度绘制标准曲线或回归方程。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

普通肝素和低分子量肝素测定 参考结果

0 U/ml。

注意事项 1.采血和离心要避免血小板激活而释放血小板第4因 子(PF4),后者可抑制肝素活性。

2.反应条件如温育时间和温度均应严格按要求进行。

3.严重黄疸者应设自身对照进行检测。

4.制作标准曲线的肝素制剂应与受检者一致。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

普通肝素和低分子量肝素测定 临床意义

血浆肝素浓度测定是监测普通肝素用量的最好方法, 国人肝素浓度控制在0.2~0.4U/mL为宜。

在过敏性休克、使用氮芥化疗或放疗后、严重肝病或 DIC、肝叶切除或肝移植等患者的血浆中肝素样抗凝物增 多。

某些肿瘤细胞可分泌肝素样物质,如肾上腺皮质肿瘤、 多发性骨髓瘤等。

肝脏损伤导致肝素在肝脏内的降解作用 减弱也可导致肝素样抗凝物增多。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

复钙交叉试验

原理 延长的复钙时间,如能被1/10量的正常血浆所纠正,

表示受检血浆中缺乏凝血因子;如果不能被等量的正常

血浆所纠正,表示受检血浆中有抗凝物质。

方法 1.常规静脉采血,0.109mol/L枸橼酸钠1:9抗凝,分离PRP。

2.用正常人血浆和受检者血浆按下表的比例混合,加在5个 小试管中,分别按复钙时间测得各自结果。

3.复钙时间测定:取血浆0.1ml置入小试管中,37℃水浴 1min,加0.025mol/L氯化钙液0.1ml,混合并立即启动 秒表,记录血浆出现纤维蛋白丝的时间。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

复钙交叉试验 操作步骤

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

复钙交叉试验 参考结果

参考值3号管2min 18s~4min。

若受检血浆与1/ 10量正常血浆混合,血浆复钙时间不在正常范围内 (2.2min~3.8min),则认为受检血浆中存在异常抗 凝物质。

注意事项 1.CaCl2溶液应新鲜配制。

2.标本不能用EDTA抗凝,标本勿溶血,否则钙化时 间缩短。

3.标本应及时测定,以免因凝血因子消耗而影响结 果。

4.严格控制离心速度和时间,血小板减少会影响本 试验结果。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

复钙交叉试验 临床意义

对无凝血因子缺陷而有出血倾向者,应做循环抗凝物 质的测定。

本试验可区别血浆复钙时间延长的原因,目前 主要用来筛检病理性抗凝物质增多。

血浆中存在异常的抗 凝物质,见于反复输血的血友病患者、肝病患者、系统性 红斑狼疮、类风湿关节炎及胰腺疾病等。

另外,复钙交叉试验对受检血浆中低浓度的肝素及类 肝素物质不敏感,必要时可考虑作肝素定量试验。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

凝血因子VIII抑制物测定

原理

将受检血浆与正常人血浆混合,温育一定时间后,测定 该混合血浆VIII因子活性,若受检血浆中存在VIII因子 抑制物,则混合血浆的VIII因子活性会降低。

以 Bethesda单位来计算抑制物的含量,能灭活正常人FⅧ活 性50%定义为l个Bethesda单位。

方法 1.用咪唑缓冲液1:1对倍稀释受检血浆和健康人混合血浆。

2.对照为1:1稀释的健康人混合血浆,为100%因子活性,按 VIII:C检测方法,测出对照的VIII:C活性百分比(A)。

3.以1:1稀释的受检血浆与等量的对照血浆混合,37℃温育 2h后,按VIII:C检测方法,确定因子VIII的活性百分比 (B)。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

凝血因子VIII抑制物测定 操作步骤

4.计算 剩余FVIII:C

= B/A×100%

按下表将剩余FVIII:C换算成Bethesda单位,并计算因子 VIII抑制物含量。

受检者稀释度 × Bethesda单位 = 每毫升血浆中因子 VIII抑制物的Bethesda单位数。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

凝血因子VIII抑制物测定 操作步骤

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

凝血因子VIII抑制物测定 操作步骤

? 举例:如果A=70%;B=35% 剩余FVIII:C = 35/70 × 100% = 50% 从表5-6中查得,50%剩余FVIII为1.0 Bethesda单位。

稀释度 × 单位 = 因子VIII抑制单位值 1 × 1.0 = 1.0 Bethesda/ml 血浆

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

凝血因子VIII抑制物测定 参考结果

正常人无因子VIII抑制物,剩余因子VIII:C 为100%。

注意事项 1.同凝血因子VIII C测定。

2.如抑制作用明显,超过VIII C检测的线性范围, 可降低受检血浆在对照血浆中的比例,重新检测。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

凝血因子VIII抑制物测定 临床意义

以 Bethesda 单位来计算抑制物的含量,不仅可用于 因子VIII抑制物检测,还可用于其他因子(IX 、X、XI) 抑制物的检测。

临床常见于反复输血或因子VIII浓缩制剂 的血友病患者,也见于某些自身免疫病患者或妊娠期间。

第十三章 第四节 抗凝物质及检验

第五节

主要内容

纤溶活性检验

1.纤溶系统的组成及其特点 2.纤维蛋白的溶解机制

3.纤维蛋白(原)降解产物的作用

4.纤溶活性相关指标的检测及临床意义

明确 诊断 方向

第十三章 第五节 纤溶活性检验

第五节

定义:

纤溶活性检验

纤维蛋白溶解系统:简称纤溶系统。

其主要

作用是将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解,起

到修复、祛除和防止血管内由于纤维蛋白沉着

( 如血栓形成 )引起的阻塞作用。

纤溶系统功能 亢进可引起出血,功能减低则可导致血栓形成, 因而纤溶系统具有重要的生理和病理意义。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤溶系统的组成及其特点

1.纤溶酶原激活物 (1)组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, t-PA)是一种由血管内皮细胞合成的单链糖蛋白,属于丝 氨酸蛋白酶。

在胰腺、肺、子宫、肾上腺、前列腺和甲 状腺等组织中含量高,正常血浆浓度仅为 6μg/L。

t-PA 与纤维蛋白具有很强的亲和力, t-PA 激活纤溶酶原主要 在纤维蛋白上进行,是体内最强的纤溶酶原激活物。

( 2 ) 尿 激 酶 样 纤 溶 酶 原 激 活 物 (urokinase-like plasminogen activator, u-PA) 是来源于肾小管上皮细 胞和血管内皮细胞的单链糖蛋白,血中含量极低,一般 不超过100pmol/L。

u-PA有单链和双链二种形式,少量的 纤溶酶和激肽释放酶可使单链 u-PA 裂解成双链 u-PA 。

uPA激活纤溶过程迅速,不依赖于纤维蛋白。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤溶系统的组成及其特点

2.纤溶酶原(plasminogen, PLG)和纤溶酶 (plasmin, PL)

PLG由肝合成的一种单链糖蛋白,以无纤溶活性的酶原 形式存在于血液中。

纤溶酶原在其激活物t-PA或u-PA作

用下转变成有纤溶活性的双链结构丝氨酸蛋白水解酶,

它除了能裂解纤维蛋白原和纤维蛋白外,还参与分解凝 血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ和因子Ⅻa等。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤溶系统的组成及其特点

3.纤溶抑制物

(1)纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor, PAI) 能特异性抑制 t-PA 和 u-PA 激活纤溶酶原,主要有二种:①纤溶酶原 抑制物 -1(PAI-1) ,其作用是和 t-PA 或 u-PA 形成复合物使其失活。

PAI-1 也可抑制凝血酶、因子Ⅸa、Ⅻa、激肽释放酶和 APC 的活性。

②纤溶酶原抑制物 -2(PAI-2) ,对 t-PA 的抑制作用较 PAI-1 弱。

正常 人血浆中无PAI-2,但在妊娠早期开始出现,随着妊娠而增高,产后 迅速减少或消失。

(2)凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI) 凝血酶激活的纤溶抑制物是一种血浆蛋白质,以酶原的形式存在。

血浆浓度约为75nM,被凝血酶-TM复合物激活后,形成具有蛋白水解 活性的TAFI(TAFIa,即羧基肽酶),TAFIa通过抑制PLG激活,抑制纤 溶酶的纤溶活性和水解纤溶蛋白的羧基端赖氨酸而抑制纤溶酶。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤溶系统的组成及其特点

3.纤溶抑制物

(3)纤溶酶抑制物 正常血浆中有多种非特异性纤溶酶抑制物,其中以 ? 2 抗纤溶酶 (?2-antiplasmin, ?2-AP) 最为重要,它与纤溶酶形成 1∶1 复合物 (PAP)使其失去蛋白水解活性。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤维蛋白的溶解机制

纤溶过程是一系列蛋白酶催化的连锁反 应,一般分为二个阶段:

1.纤溶酶原被激活为纤溶酶

2.纤溶酶水解纤维蛋白(原)及其他蛋白质

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤维蛋白的溶解机制

1.纤溶酶原激活途径

( 1 )内激活途径 主要指血循环中内源凝血途径中某 些因子,如因子Ⅻa、 K 等能激活纤溶酶原形成纤溶酶。

( 2 )外激活途径 主要指体内合成的某些激活物,如 t-PA、u-PA等进入循环,激活纤溶酶原形成纤溶酶。

( 3 )外源激活途径 主要指外界进入体内的某些药物, 如链激酶 (SK) 、尿激酶 (UK) 等激活纤溶酶原形成纤溶 酶,这是溶栓治疗的基础。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤维蛋白的溶解机制

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤维蛋白的溶解机制

2.纤维蛋白(原)降解机制 ( 1 )纤维蛋白原的降解 纤溶酶首先作用于 纤维蛋白原Bβ链,释放出纤维蛋白Bβ1-42肽; 又作用于A?链,释放出其附属物A、B、C、H, 即 A? 羧基端的四个小片段,剩下的部分称为 X 片段,然后 X 片段再依次被纤溶酶裂解出 Y 、 D 、 E 片段。

纤溶酶对纤维蛋白原的裂解见于原发 性纤溶。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤维蛋白的溶解机制

2.纤维蛋白(原)降解机制

( 2 )可溶性纤维蛋白的降解 可溶性纤维蛋白是纤维 蛋白原被凝血酶降解释放出肽 A(A?1-16) 和肽B(Bβ114)后形成的产物。

纤溶酶作用于可溶性纤维蛋白后释 放出Bβ1-14 肽,不含FPA的裂解片段分别用 X’、Y’、D’、 E’命名。

( 3 )交联纤维蛋白的降解 在纤溶酶的作用下交联纤 维蛋白除降解出碎片X’、Y’、D’、E’外,还生成D-D二聚 体和DD/E、DY/YD、YY/DXD等复合物。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤维蛋白的溶解机制

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤维蛋白(原)降解产物的作用

纤溶酶对纤维蛋白和纤维蛋白原的裂解产物统称 为 纤 维 蛋 白 ( 原 ) 降 解 产 物 (fibrin/fibrinogen degradation product , FDP) 。

FDP 可与纤维蛋白原竞 争凝血酶,阻止纤维蛋白单体 (FM) 形成,并可与 FM 结 合形成可溶性复合物,抑制 FM 聚合和交联成不溶性纤 维蛋白,发挥抗凝作用。

而交联纤维蛋白的裂解产物D

二聚体发生在继发性纤溶之后,对于区别原发性与继

发性纤溶有较高的价值。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤维蛋白(原)降解产物的作用

第十三章 第五节 纤溶活性检验

纤溶活性的检测及临床意义

1.优球蛋白溶解时间测定 2.血浆组织纤溶酶原激活物测定 3.血浆纤溶酶原测定

4.血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定

5.血浆a2-抗纤溶酶活性测定 6.血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验

第十三章 第五节 纤溶活性检验

优球蛋白溶解时间测定

1.优球蛋白溶解时间(euglobulin lysis time,ELT)测定 原理血浆优球蛋白组分中含纤维蛋白原、纤溶酶原和纤溶酶 原激活物等,但不含纤溶酶抑制物。

用低离子强度和Ph4.5的

溶液沉淀和分离优球蛋白,再溶于缓冲液中,加钙或凝血酶

使其凝固,测定凝块完全溶解的时间,即优球蛋白溶解时间。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

优球蛋白溶解时间测定

试剂 (1) 0.109mol/L枸橼酸钠。

(2) 0.025 mol/L 氯化钙溶液(或2U/ml 凝血酶溶液)。

(3) 1% 醋酸溶液。

(4) 硼酸盐溶pH9.0:氯化钠9g、硼酸钠1g、蒸馏水加至

1000ml。

优球蛋白溶解时间测定

方法

(1) 快速分离枸櫞酸抗凝血浆。

(2) 取尖底离心管 1 支,加蒸馏水 7.5ml 和 1% 醋酸溶液 0.12ml ,使 pH 为 4.5,置冰浴中。

(3) 取血浆 0.5ml加到上述离心管中,混匀,继续置冰浴中 10min,使优 球蛋白充分析出。

(4) 以 3000r/min 离心5min,倾去上清液,倒置离心管于滤纸上,吸去 残余液体,沉淀即为优球蛋白。

(5) 加硼酸盐缓冲液 0.5ml于沉淀中,37℃水浴,轻轻搅拌使沉淀溶解。

(6) 加 0.025 mol/L 氯化钙溶液(或2U/ml 凝血酶溶液)0.5ml,凝固 时开始计时。

置 37℃水浴中观察凝块完全溶解不见絮状物为止,所 需时间即为ELT。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

优球蛋白溶解时间测定

参考区间

加钙法:129min48s±4min6s

加凝血酶法:123±24min

第十三章 第五节 纤溶活性检验

优球蛋白溶解时间测定

注意事项 (1) 采血时尽量减少创伤,止血带不宜扎得过紧,时间不 得超过 5min ,以免组织和血管内皮细胞释放纤溶 酶原激活物。

(2) 第 1 ~ 2 步骤应在 15min 内完成,以免纤溶酶抑制物中 和造成假阳性。

(3) 采血前应避免过度活动和进油脂食物。

(4) 本实验对pH、离子强度、温度、和操作额的差异都比 较敏感,应严格遵守操作规程,并应建立本实验 室的参考值。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

优球蛋白溶解时间测定

应用评价

(1) ELT 缩短( <70min )表明纤溶活性增强,见于原发性 和继发性( DIC )纤溶亢进。

但在 DIC 早期尚未发 生继发性纤溶亢进是,或当纤溶极度亢进,纤溶 酶绝大部分已被消化时,可为阴性。

(2) ELT 延长表明纤溶活性减低,见于血栓形成前期和血 栓形成性疾病。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆组织纤溶酶原激活物测定

2. 组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, t-PA)测定

原理根据双抗体夹心法原理,将纯化的组织纤溶酶原激活物

(t-PA )单克隆抗体包被在反应板上,加入待测样本和标准 品,加过氧化物酶标记的t-PA抗体,再加邻苯二胺(OPD)显 色后读取A值,计算出其血浆浓度。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆组织纤溶酶原激活物测定

试剂

(1) t-PA ELISA法试剂盒

(2) 洗涤液 0.025 mol/L 氯化钙-聚山梨醇。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆组织纤溶酶原激活物测定

方法 (1) 常规采血,分离PPP。

(2) 试剂盒要求将待测血浆和标准品加入包被好的反应板孔 内,37℃温育1h后,洗涤甩干。

(3) 加过氧化物酶标记抗体,37℃温育1h后洗涤甩干,立即 加OPD显色(避光)。

(4) 显 色 20min( 室 温 ) , 以 4mol/L 硫 酸 终 止 反 应 , 在 波 长 492nm的酶标仪上读取A值。

(5) 制成直线回归方程,并计算出t-PA的样本浓度。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆组织纤溶酶原激活物测定

参考区间

t-PA:1~12μg/L 注意事项 (1) 以早晨采血为佳,且采血时不要加压或使用 止血带,以免影响结果。

(2) 所用器材需硅化或用塑料制品。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆组织纤溶酶原激活物测定

应用评价

(1) t-PA增高见于应激反应、剧烈运动、先天性增高以及 纤溶亢进时。

(2) 减低往往见于高凝状态和血栓性疾病、口服避孕药、 肥胖症等。

PAI 增高见于血栓性疾病和高凝状态, 减低见于原发性或继发性纤溶症。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆纤溶酶原测定

3.血浆纤溶酶原测定 (plasminogen, PLG)测定

原理受检血浆(含抗原)加到含抗纤溶酶原血清的琼脂糖扩 散板中,自然扩散一定时间后,通过测定抗原抗体反应沉淀 弧的直径来计算受检者血浆纤溶酶原含量。

其直径与PLG含量 呈正相关。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆纤溶酶原测定

试剂 (1) 抗人纤溶酶原血清和标准血浆。

(2) pH8.2巴比妥缓冲液。

(3) 琼脂糖。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆纤溶酶原测定

方法

(1) 常规采血,分离PPP。

(2) 制备免疫扩散板 以巴比妥缓冲液配制的 2%琼脂糖溶液与等量抗血

清混合后制成宁搅拌。

用打孔器在板上以间距 15mm 等距打孔,孔径 3mm。

(3) 将标准血浆用巴比妥缓冲液作 1﹕2、1﹕4、1﹕8、 1﹕16稀释,待

测血浆作1﹕2稀释,加入反应板加样孔中(10μl/孔)。

(4) 置 37℃温箱24h,精确测量沉淀弧直径,制成直线回归方程,并计

算出待测样本的浓度。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆纤溶酶原测定

参考区间

PLG: 230~340mg/L 注意事项 (1) 纤溶酶原抗原测定可与纤溶酶原活性(发色底物法) 同时检测,以便全面了解体内纤溶酶原合成状态。

(2) 免疫扩散中要注意保持一定的湿度,避免凝胶扩散板 的干裂,但过湿又可引起水蒸气稀释样本。

(3) 免疫扩散后沉淀弧边缘不清可提示抗原抗体反应浓度 不适,抗血清的工作浓度,重复测定。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆纤溶酶原测定

应用评价

(1) 血浆纤溶酶原含量减低可见于先天性纤溶酶原缺乏症,

但更常见于纤溶酶原激活物活性增强的情况,如 原发性和继发性纤溶亢进、溶栓治疗后、重症肝 炎、肝硬化、肝叶切除术、大手术后、肿瘤播散、 严重感染等。

(2) 纤溶酶原含量增多往往反应纤溶活性的降低,如高凝 状态和血栓性疾病。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定

4. 血 浆 组 织 纤 溶 酶 原 激 活 物 抑 制 物 测 定 (plasminogen activator inhibitor, PAI)测定 原理根据双抗体夹心法原理,将纯化的纤溶酶原激活物抑制 物(PAI)单克隆抗体包被在反应板上,加入待测样本和标准

品,加过氧化物酶标记的 PAI 抗体,再加邻苯二胺(OPD )显

色后读取A值,计算其血浆浓度。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定

试剂

(1) PAI ELISA法试剂盒。

(2) 洗涤液 0.025 mol/L 氯化钙-聚山梨醇。

方法

(1) 常规采血,分离PPP。

(2) 试剂盒要求将待测血浆和标准品加入包被好的反应板孔内,37℃温 育1h后,洗涤甩干。

(3) 加过氧化物酶标记抗体,37℃温育1h后洗涤甩干,立即加 OPD显色 (避光)。

(4) 显色20min(室温),以4mol/L硫酸终止反应,在波长492nm的酶标仪 上读取A值。

(5) 制成直线回归方程,并计算出PAI的样本浓度。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆组织纤溶酶原激活物抑制物测定

参考区间 PAI: 2~10μg/L

注意事项

(1) 以早晨采血为佳,且采血时不要加压或使用止血带, 以免影响结果。

(2) 所用器材需硅化或用塑料制品。

应用评价

(1) PAI增高见于血栓性疾病和高凝状态。

(2) 减低见于原发性或继发性纤溶症。

第十三章

第五节 纤溶活性检验

血浆a2-抗纤溶酶活性测定

5.血浆a2-抗纤溶酶活性(?2-antiplasmin, ?2-AP)测定 原理在待测标本中加入过量的纤溶酶,纤溶酶与标本中的 a2-AP结合形成复合物,剩余的纤恪酶水解发色底物S2251, 使底物释放出对硝基苯肢 (PNA),生色的深浅与α2-AP 活性

成反比。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆a2-抗纤溶酶活性测定

试剂 (1) 纤溶酶。

(2) 发色底物S2251。

(3) 标准血浆(20个以上的正常人混合血浆)。

(4) 2mol/L 的硫酸终止液。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆a2-抗纤溶酶活性测定

方法 (1) 将标准血浆稀释10倍,设此时α2-AP 活性为200%,按表1加入到酶标 板上。

(2) 将待测标本用缓冲液作20 倍稀释,取100μl加入到酶标板中,37℃ 保温10 min。

(3) 将发色底物及纤溶酶分别用1ml 缓冲液溶解,37℃保温30min。

(4) 吸取50μl纤溶酶加入到待测标本中,37℃准确保温2 min。

(5) 吸取50μl发色底物加至上述孔中,混匀,置室温1 min 左右。

加终 止液20μI ,检测405 nm吸光度。

(6) 以405nm吸光度为纵坐标,以α2-AP: A为横坐标,绘制标准曲线。

(7) 以待测标本的405nm吸光度值在标准曲线上查出α2-AP: A ,再乘以 稀释倍数就得到待测血浆的α2-AP: A。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆a2-抗纤溶酶活性测定

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆a2-抗纤溶酶活性测定

参考区间 α2-AP: A : 95.6±12.8% 注意事项 (1) 试剂溶解后应一次用完。

(2) 样品稀释度,视显色深浅可作适当调整。

(3) 底物的作用时间应根据标准曲线各孔的显色程度来决定。

(4) 所有试剂都必须新鲜配制。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆a2-抗纤溶酶活性测定

应用评价

(1) α2-AP: A升高见于动脉和静脉血栓形成、产后、恶性 肿瘤等。

(2) α2-AP: A 降低见于肝病、手术后、 DIC 、和先天性 α2-AP缺乏症。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验

6. 血 浆 硫 酸 鱼 精 蛋 白 副 凝 固 (plasma protamine paracoagulation, 3P) 试验 原理纤维蛋白原在凝血酶作用下释放出A肽和B肽后转变成纤 维蛋白单体(FM)。

FM具有自行聚合呈肉眼可见的纤维、絮状 或胶冻装的特性。

如发生继发性纤溶,存在纤维蛋白降解产 物,尤其X’片段可和FM形成可溶性复合物,而硫酸鱼精蛋白 具有分离这种复合物的能力,可使FM游离出来,形成肉眼可 见的纤维素样物质,称为血浆鱼精蛋白副凝固试验 , 也称 3P 试验。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验

试剂 (1) 0.109mol/L枸橼酸钠。

(2) 1%硫酸鱼精蛋白溶液。

方法 (1) 常规采血,分离PPP。

(2) 取0.5mlPPP置37℃水浴3min。

(3) 加入 0.05ml(1/10 血浆量 ) 的1% 硫酸鱼精蛋白溶液, 置37℃水浴15min,立刻观察结果。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验

参考区间 阴性:血浆透明,清晰,无不溶解产物;

阳性:含细颗粒沉淀、粗颗粒沉淀、纤维蛋白丝网或

胶冻样物质。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验

注意事项 (1) 本试验为检测继发性纤溶有较好特异性的试验,但不太敏感。

(2) 3P试验血浆不能以草酸盐、EDTA和肝素作抗凝剂。

(3) 抽血不顺利、抗凝不均或抗凝剂不足、导管内抽血、严重贫血(抗凝

剂相对不足)、久置冰箱或反复冻融的标本,或加硫酸鱼精蛋白 前标本预温时间不够等,均会导致假阳性。

(4) 水浴箱温度太低或纤维蛋白原含量过低均会造成假阴性。

(5) 因血小板第 4因子可使 FM-X转变为纤维蛋白,故分离血浆应高速离心 制成PPP。

(6) 并非各种来源的硫酸鱼精蛋白都适用于此试验,故应做预试验。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验

应用评价 (1) 正常为阴性。

(2) 阳性见于 DIC 早期、中期,严重创伤,大手术,咯血、

呕血以及久置冰箱的样品。

(3) DIC 晚期和原发性纤溶 ( 因血中无 FM) 时也表现为阴性。

故在区别原发性和继发性纤溶时有一定意义。

第十三章 第五节 纤溶活性检验

第六节 血栓形成

学习要点

?

了解血栓的分类,血栓的形成机制及血栓对机体

的影响。

?

理解并掌握血栓前状态实验室检查的临床应用及

评价。

第十三章 第六节 血栓形成

一、基本理论

血栓分类

?白色血栓:血小板+少量纤维蛋白

动脉内

?混合血栓:头+体+尾

?红色血栓:RBC+WBC

静脉内

?透明血栓:微血栓

微循环内 DIC、休克

第十三章 第六节 血栓形成

一、基本理论

血栓形成机制

PLT量和 活性↑

心血管 内皮细 胞损伤

血液凝 固性↑

血流状 态改变

第十三章 第六节 血栓形成

血栓对机体的影响

阻塞血管

栓塞

心瓣膜变形 广泛性出血

第十三章 第六节 血栓形成

二、血栓前状态检验

血浆血栓烷B2检测 ,TXB2 花生四烯酸 血栓A2(TXA2) (不稳定) 血栓烷B2(TXB2) (稳定,ELISA)

第十三章 第六节 血栓形成

血浆血栓烷B2检测 ,TXB2

原理 用血栓烷B2(thromboxane B2,TXB2)-牛血清白蛋白

包被酶标反应板,加入受检血浆或TXB2标准品和抗 TXB2抗体。

包被的TXB2与受检血浆中或标准品中TXB2 竞争性与抗TXB2抗体结合,包被的TXB2与抗体结合的 量与受检血浆中TXB2的含量成负相关。

加酶标第二抗 体及底物,根据显色程度推算出样品的TXB2的含量。

第十三章 第六节 血栓形成

TXB2 操作

1.标本采集 可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30min内于2 ℃- 8℃ 3000r/min 离心15min,或将标本放于-20℃或-80℃保存, 但应避免反复冻融。

2.将TXB2-BSA用碳酸盐缓冲液做一定稀释后包被酶标反应板,0.3% 明胶封闭。

3.TXB2标准品稀释 系列倍比稀释成浓度为12.5 ng/L、25 ng/L、 50 ng/L、100 ng/L、200 ng/L、400 ng/L、800 ng/L和1600 ng/L的8个标准点,临用前15min内配制。

4.加样 将不同浓度的标准品或待测样品血浆0.1ml加入微孔板中, 然后加入0.1ml兔抗TXB2 IgG,注意不要有气泡,样品加样于酶标 板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆 膜,置于37℃水浴中温育2h。

第十三章 第六节 血栓形成

TXB2 操作

5.洗涤 弃去孔内液体,用洗涤液洗涤4次,甩干。

6.加0.2ml酶标第二抗体,37℃水浴2h。

以OPD-过氧化氢为基质显 色20min。

7.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应。

终止液的加入顺序应尽 量与底物液的加入顺序相同。

为了保证实验结果的准确性,底物 反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在490nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

在加终 止液后15min以内进行检测。

第十三章 第六节 血栓形成

TXB2 操作

9.标准曲线与计算 A标准品或样品—A非特异 B/B0(%)= —————————————×100% A零标准品—A非特异 以标准品的浓度为横坐标,B/B0(%)为纵坐标,在半对数纸上绘制 出标准曲线。

根据样品B/B0(%)值由标准曲线查出相应的浓度, 再乘以稀释倍数;或用标准品的浓度与B/B0(%)值计算出标准曲 线的直线回归方程式,将样品的B/B0(%)值代入方程式,计算出 样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

第十三章 第六节 血栓形成

TXB2 参考区间

(28.2~124.4)ng/L

注意事项

1.实验前10天必须停用阿司匹林类药物。

2.为避免激活血小板引起假性升高,不能选用其他抗凝剂。

3.采血顺利,尽快分离血浆。

4.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。

5.一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排 枪加样。

6.洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。

第十三章 第六节 血栓形成

TXB2 临床意义

本实验受血小板影响因素较大,因此采血后应立即试验,并避免一些激 活或影响血小板活性的药物及物品。

1.TXB2增高 见于血栓性疾病和血栓前状态,如动脉粥样硬化、心肌梗 死、肺梗死、糖尿病、高脂血症、妊高症、DVT、恶性肿瘤、大手 术后等。

2.TXB2 减低 见于先天性血小板花生四烯酸代谢障碍性疾病或服用阿 司匹林、磺吡酮、咪唑及其衍生物等药物后。

第十三章 第六节 血栓形成

凝血酶原片断1+2检测 , F1+2

原理

用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,住包 被单抗的微孔中依次加入凝血酶原片断1+2 (prothrombin fragment 1+2, F1+2)抗原、生物素 化的抗人F1+2抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗 涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化 成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的 深浅和样品中的F1+2呈正相关。

用酶标仪在450nm波长

下测定吸光度(OD值),计算样品含量。

第十三章 第六节 血栓形成

F1+2 操作

1.加样 分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液 100μl,余孔分别加标准品或待测样品100 μl,注意不要有气泡, 加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻摇混匀,加盖 或覆膜,37℃反应120min。

2.弃去液体,甩干,不用洗涤。

每孔加生物素化的抗人F1+2抗体工作 液100μl(以1μl生物素化的抗人F1+2抗体原液加99μl检测稀释 液的比例配制,轻轻混匀,使用前1小时内配制),37℃,60分钟。

3.温育60min后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1~2min, 350μl/孔,甩干。

4.每孔加HRP标记的亲和素工作液100μl(以1μl HRP标记的亲和素 原液加99μl检测稀释液的比例配制,轻轻混匀,使用前1h内配 制),37℃,60min。

第十三章 第六节 血栓形成

F1+2 操作

5.温育60min后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2min, 350μl/孔,甩干。

6.依序每孔加底物TMB溶液90μl,37℃避光显色(30min内,此时肉 眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显, 即可终止。

7.依序每孔加终止溶液90μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

终 止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

为了保证实验结 果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

在加终止 液后15min以内进行检测。

第十三章 第六节 血栓形成

F1+2 参考区间

(0.29~1.05)nmol/L 注意事项 1.洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。

2.一次加样时间最好控制在5min内,如标本数量多,推荐使用排 枪加样。

3.受检血浆必须以3000rpm/min以上离心分离。

4.每次测定时同时做空白对照和标准曲线,最好做复孔。

5.如标本中待测物质含量过高,须先稀释后再测定,计算时最后 乘以稀释倍数。

第十三章 第六节 血栓形成

F1+2 临床意义

血浆F1+2反映了凝血酶原酶的活性,是凝血酶生成的标志,含 量增高代表FXa增高和凝血活性亢进,临床上用此试验判 断凝血第二阶段的状况。

1.增高 见于血栓前状态和血栓性疾病,DIC、深静脉血栓形 成、肺栓塞、急性白血病、先天性和获得性抗凝血酶缺乏 症、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症等,口服避孕药及雌激素 替代治疗时也可升高。

2.减低 见于口服抗凝剂患者,可作为口服抗凝剂的监测指 标。

第十三章 第六节 血栓形成

血浆凝血酶-抗凝血酶复合物检测 ,TAT

原理 应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定血浆凝血 酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin, TAT) 水平。

用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往 包被单抗的微孔中依次加入TAT抗原、生物素化的抗 人TAT抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底 物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样 品中的TAT呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸 光度(OD值),计算样品浓度。

第十三章 第六节 血栓形成

TAT 操作

1.加样 分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔 加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品 100 μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔 底部,尽量不触及孔壁,轻摇混匀,酶标板加上盖或覆 膜,37℃反应120分钟。

2.弃去液体,甩干,不用洗涤。

每孔加检测溶液A工作液 100μl(取1μl检测溶液A加99μl检测稀释液A的比例 配制,轻轻混匀,在使用前1小时内配制),37℃,60分 钟。

3.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次 浸泡1~2分钟,350μl/孔,甩干。

4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100μl, 37℃,60分钟。

第十三章 第六节 血栓形成

TAT 操作

5.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次 浸泡1~2分钟,350μl/孔,甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内, 此时肉眼可见标准品的前3~4孔有明显的梯度兰色,后 3μ4孔梯度不明显,即可终止。

7.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转 黄色)。

终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序 相同。

为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后 应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

在加终止液后15min以内进行检测。

第十三章 第六节 血栓形成

TAT 参考区间

(1.0~4.1) μg/L

第十三章 第六节 血栓形成

TAT 注意事项

1.标本质量会影响最后检测结果,因此溶血、脂

血、含类风湿因子的标本不宜进行此项检测。

2.受检标本应4℃保存,72小时内测定。

3.如标本中待测物质含量过高,须先稀释后再测 定,计算时最后乘以稀释倍数。

4.每次测定时同时做空白对照和标准曲线,最好 做复孔。

第十三章 第六节 血栓形成

TAT 临床意义

TAT是血栓前状态十分重要的检测指标,其血浆水平 在DIC前期即升高,所以TAT可作为DIC及Pre-DIC的诊断指 标,其特异性和敏感性达80%~90%。

1.TAT含量增高代表FXa增高和凝血活性亢进,见于血栓前状 态和血栓性疾病,如DIC、急性心肌梗死、不稳定型心绞 痛、深静脉血栓形成、脑梗死、急性白血病等。

2.典型DIC时明显升高,抗凝治疗有效后,TAT下降。

在急性 心肌梗死的患者接受溶栓治疗后,如血浆TAT水平仍高于 6μg/L,则有再梗死可能。

第十三章 第六节 血栓形成

血浆纤溶酶-α2-抗纤溶酶复合物检测 ,PAP

原理 血浆纤溶酶-α2-抗纤溶酶复合物(plasmin-α2antiplasmin complex,PAP)检测:用抗纤溶酶原抗 体包被微孔板,加入受检血浆,血浆中纤溶酶原和 PAP中纤溶酶原部分与包被抗体结合于固相载体上。

加入过氧化物酶标记的抗α2-抗纤溶酶抗体,它只与 已结合在包被抗体上的PAP中的α2-抗纤溶酶部分结合。

加入邻苯二胺显色,颜色的深浅和样品中的PAP含量 呈正相关。

第十三章 第六节 血栓形成

PAP 操作

1.以稀释好的包被抗体包被反应板,100μl/孔,37℃孵育3小时后, 4℃过夜,洗涤3次后备用。

2.分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液100μl, 余孔分别加标准品或待测样品100 μl,注意不要有气泡,加样将 样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻摇混匀,酶标板加上 盖或覆膜,37℃反应3小时,洗涤3次,甩干。

3.加过氧化物酶标记的抗α2-抗纤溶酶抗体(已稀释),100μl/孔, 37℃3小时,洗涤3次。

4.每孔加基质液100μl,室温30分钟,2mol/l硫酸50μl/孔终止反 应后,用酶联仪在492nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

5.用PAP标准品浓度与相应A值制成标准曲线(回归方程),求得受检 标本PAP值,再乘以稀释倍数即为最终结果。

第十三章 第六节 血栓形成

PAP 参考区间

( 0.12~0.7)mg/L

第十三章 第六节 血栓形成

PAP 注意事项

1.包被抗体为抗纤溶酶原抗体,本试验会出现 较明显的非特异性结合及显色反应,因此, 终止反应要迅速,尽量避光操作。

2.如标本中待测物质含量过高,须先稀释后再 测定,计算时最后乘以稀释倍数。

3.酶标板、浓缩液和冻干品应2~8℃保存,配 好的稀释液2~8℃保存不超过1个月,冻干 品复溶后置于-20℃可保存3周。

第十三章 第六节 血栓形成

第七节 血液流变学及检验

学习要点

?主要血液流变学检验的原理、注意事项及临床意义。

第十三章 第七节血液流变学及检验

第七节 血液流变学及检验

基本理论 血液流动性和粘滞性 影响血液粘度的因素 血液流变学检验 全血粘度测定 血浆粘度测定 红细胞聚集性测定 红细胞变形性测定 红细胞电泳时间测定

第十三章 第七节血液流变学及检验

一、基本理论

血液流动性和粘滞性

?血液流变学定义

血液流变学是研究血液的流动性和粘滞性、 血液中的红细胞和血小板的聚集性、血浆的流 动性、血液和血浆的粘滞性等方面的一门分支 科学。

在血管疾病中有重要意义。

第十三章 第七节血液流变学及检验

一、基本理论 ? 影响血液粘度的因素

–心脏的泵力 –血管的状态 –血液的状态

? 血细胞容积 ? 红细胞的变形性 ? 红细胞聚集性 ? 血浆粘度

第十三章 第七节血液流变学及检验

血液流变学实验室检查

全血粘度测定

原理 血液流动时,其内摩擦力阻碍血液的流动,这种

阻碍血液流动的内摩擦力就是血液的粘性。

度量这种血

液粘性的物理量,就是血液粘度,血液粘度的单位用国 际单位制表示,就是毫帕﹒秒(mPa﹒s)。

血粘度是衡量血液流动性的指标,粘度愈高流动性愈差, 粘度愈低流动性愈好。

临床常用毛细管粘度计或旋转式粘 度计进行测量。

第十三章 第七节血液流变学及检验

全血粘度测定 参考区间

毛细管粘度计法: 男为 (4.25±0.41) mPa.s

女为

(3.65±0.32)

mPa.s

旋转式粘度计法: 男 230s-1时为(4.53±0.46)mPa.s; 11.5s-1时为(9.31±1.48)mPa.s 女 230s-1时为(4.22±0.41)mPa.s;

11.5s-1时为(8.37±1.22)mPa.s

第十三章 第七节血液流变学及检验

全血粘度测定

应用评价

血液粘度是重要的综合性指标,可对高粘滞血症进行诊 断、预防和治疗。

血液粘度增大,血流阻力增大 ,血液流 量和血液组织灌注降低,严重者可出现微循环障碍。

? ? ? ?

低血液粘度 高、中、低切都升高,且幅度较大 低切高、高切不高 高、中、低切都略有升高

第十三章 第七节血液流变学及检验

全血粘度测定

高粘滞血症的病因

? ? ? ? 血管性疾病 代谢性疾病 血液病 其他

第十三章 第七节血液流变学及检验

血浆粘度测定

血浆粘度的特点是不随切变率的变化而变化,

不论在高或低切变率范围内总是一个常数, 即为

牛顿液体。

血浆粘度的高低与其中所含各种蛋白质、糖类、 脂类等高分子物质含量有关。

其中蛋白质对血浆粘 度影响最大。

第十三章 第七节血液流变学及检验

血浆粘度测定

参考区间

男为 女为 (1.76±0.04)mPa.s (1.78±0.06)mPa.s

第十三章 第七节血液流变学及检验

血浆粘度测定

应用评价

–血浆蛋白是影响血浆粘度的主要因素,血浆蛋白中 主要是纤维蛋白原和其他血浆蛋白含量,分子形成和 大小都是影响血浆粘度的主要因素。

–血浆为牛顿液体,血浆粘度升高可以引起全血粘度 的升高,但不成正比关系。

–血浆粘度升高 ?最大的可能是纤维蛋白原等链状蛋白升高。

?至于血糖、血脂高引起的血浆粘度一般只是略有 升高。

–血浆粘度降低 ?主要见于各种原因的血液稀释及低蛋白血症等。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞聚集性测定

在血液处于静置或极为缓慢的流动时,红细胞 是处于聚集状态的,这是血液非牛顿液体特性的一

大原因。

它对于低切变率下的流动有极大影响,低

切变率下的红细胞聚集使血液粘度升高;其升高程 度与聚集程度之间呈正相关。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞聚集性测定

红细胞沉降率在一定程度上反应红细胞的聚集 性,但受红细胞比容、血浆粘度、红细胞表面电荷、 温度以及血浆与细胞之间密度差等因素的影响。

因 此可利用血沉方程求出K值,由K值估计红细胞的聚 集性。

也可通过低切变率下血液的相对粘度(ηr) 反映红细胞聚集性。

当红细胞膜发生病变,或血浆中的成分影响到 红细胞膜,使红细胞膜表面的负电荷量减少,则红 细胞的聚集性增加。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞聚集性测定

参考区间

K值的均值为53±20。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞聚集性测定

应用评价

–低切变率下的红细胞聚集使血液粘度升高;其升高 程度与聚集程度之间呈正相关。

–引起红细胞聚集的因素是多方面的,如:包括 ?⑴某种病理原因使红细胞表面产生粘着性物质; ?⑵红细胞表面电荷的减少或消失; ?⑶基于某种物质分子的媒介作用,使红细胞结合 而发生聚集; ?⑷红细胞膜的性质发生变化; ?⑸介于红细胞之间的长链高分子如:纤维蛋白原, 凝血酶原,高分子右旋糖酐,羟基纤维素,聚乙烯 氮环等,都能使红细胞发生强烈的聚集。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞变形性测定

红细胞变形性是指红细胞的外力作用下其形态

变化的能力称为变形性。

血液在高切变率下的粘度低于中、低切变率下的粘度,这 主要是由于红细胞并非刚性粒子,它在高切变率下沿剪切力

的方向趋向,并发生变形。

这使得流动阻力变小,表现为粘

度下降。

因此,在特定的高切变率下(通常为200S-1)测定血 液的粘度可以度量红细胞变形能力。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞变形性测定

参考区间

180s-1 时 <1.00。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞变形性测定 应用评价

–细胞膜的弹性与粘弹性:细胞膜的脂肪成分中含有 胆固醇,它对膜具有硬化作用。

氧分压过低,就会引 起ATP与血红蛋白的结合,其结果使红细胞膜内APT 浓度降低,引起膜硬化。

–溶血性贫血、急性心梗、脑血栓形成、高脂血症、 肝硬化、糖尿病、休克等患者的红细胞变形能力都有 不同程度的减退。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞电泳时间测定

–红细胞表面带负电荷,在电场的作用下向正极移动, 这个过程叫做电泳。

–红细胞的电泳速度可以反应出红细胞表面电荷的多少。

–表面电荷越多,聚集性越小,静电排斥力也越大,电 泳时间也越短。

–表面电荷越少,聚集性越大,静电排斥力越小,电泳 时间也越长。

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞电泳时间测定

参考区间

(14.6 ~ 18.2)s

第十三章 第七节血液流变学及检验

红细胞电泳时间测定 应用评价

–红细胞电泳速度增加:提示红细胞及血小板 聚集性增强、血液粘度增高,易形成血栓性疾 病。

–红细胞电泳速度减少:提示红细胞、血小板 带电荷强,血液粘度下降。

第十三章 第七节血液流变学及检验

PAP 临床意义

本试验是反映纤溶酶活性较好的试验,用于高纤溶酶血症 和溶栓治疗的临床检测。

1.PAP增高见于血栓前状态和血栓性疾病,如急性心肌梗 死、肺梗死、脑血栓形成、深静脉血栓形成、肾病综 合征等。

2.PAP水平的增高与DIC的发展相平行,PAP水平的降低与 DIC的缓解相关,在DIC的诊断中具有重要价值。

第十三章 第六节 血栓形成


  • 与《第十三章 血栓与止血检验》相关:
  • 第五章血栓与止血检验
  • 第4章 止血与血栓的一般检验
  • 血栓与止血检验四
  • 血栓与止血检验的基本方法
  • 血栓与止血检验进展
  • 血栓与止血检验
  • 血栓与止血的检验
  • 第五篇 血栓与止血检验
  • 第五节 血栓与止血一般检验
  • 理论第3章 止血与血栓检验
  • 本站网站首页首页教育资格全部考试考试首页首页考试首页职业资格考试最近更新儿童教育综合综合文库22文库2建筑专业资料考试首页范文大全公务员考试首页英语首页首页教案模拟考考试pclist学路首页日记语文古诗赏析教育教育资讯1高考资讯教育头条幼教育儿知识库教育职场育儿留学教育高考公务员考研考试教育资讯1问答教育索引资讯综合学习网站地图学习考试学习方法首页14托福知道备考心经冲刺宝典机经真题名师点睛托福课程雅思GREGMATSAT留学首页首页作文
    免责声明 - 关于我们 - 联系我们 - 广告联系 - 友情链接 - 帮助中心 - 频道导航
    Copyright © 2017 www.xue63.com All Rights Reserved